不同處理?xiàng)l件小黑豆乳清蛋白的抗腫瘤作用

王 菲，王常青*，樊 迎，于書佳，原 敏，連偉帥

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006)

黑豆為豆科植物大豆(Glycine max(L.) merr)的黑色種子[1]，黑豆主要分布在我國(guó)“三北”地區(qū)，約占全國(guó)大豆栽培面積的8%左右。黑豆按顆粒大小分為大粒種黑豆(大黑豆)和小粒種黑豆(小黑豆)。小黑豆俗稱馬料豆，蛋白質(zhì)含量比其他種類的大豆約高10%，達(dá)50%左右[2]，不但是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的高蛋白食材，而且從中醫(yī)角度來講有補(bǔ)腎強(qiáng)身、解毒益肝、壯筋骨、抗衰老之功效[3]。研究表明，在小黑豆蛋白中，乳清蛋白為8%～10%，其含量和分子質(zhì)量分布與其他大豆略有不同。小黑豆乳清蛋白中的主要成分是胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor，TI)，TI被普遍認(rèn)為是抗?fàn)I養(yǎng)因子，可抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，降低蛋白質(zhì)的消化和吸收利用，同時(shí)TI還可作用于胰腺，造成胰腺肥大。有研究認(rèn)為，低濃度的TI可以降低癌癥發(fā)病率[1]，但本實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)，含TI 68%的乳清蛋白在低于1.5g/kg攝入劑量時(shí)，并不能體現(xiàn)顯著的抗腫瘤效果；而高于3g/kg劑量時(shí)抗腫瘤效果較好，但會(huì)造成動(dòng)物胰腺腫大。所以，本實(shí)驗(yàn)研究不同溫度熱處理小黑豆乳清蛋白，以求得在保持一定的抗癌活性的同時(shí)，降低其抗?fàn)I養(yǎng)性。實(shí)驗(yàn)還比較不同溫度處理的小黑豆乳清蛋白的抗腫瘤作用及其對(duì)免疫功能的影響，以研究和探討小黑豆乳清蛋白處理方法與抗腫瘤效果之間的關(guān)系，為小黑豆乳清蛋白功能食品的開發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用小黑豆由山西省靜樂縣農(nóng)業(yè)局提供；S180腹水瘤由山西省腫瘤醫(yī)院提供；綿羊紅細(xì)(SRBC)和豚鼠血清由山西醫(yī)科大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室提供；SPF級(jí)昆明小鼠，雄性，4周齡，體質(zhì)量18～22g，山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

2,4-二硝基氯苯(DNCB) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；注射用環(huán)磷酰胺 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；Na-苯甲酰-DL-精氨酸對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽(BAPNA) 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Sephadex凝膠色譜系統(tǒng)、UVD-680-3紫外檢測(cè)儀上海金達(dá)生物科技有限公司；SP-2012UVPC紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；低溫高速離心機(jī) 上海蘭亭設(shè)備有限公司；勻漿器 上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司；光學(xué)顯微鏡 上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小黑豆乳清蛋白的制備與處理

將脫脂小黑豆粉與水按質(zhì)量比1:10混合，用NaOH調(diào)pH8.5，55℃提取1h，離心取上清；沉淀物以前述工藝提取2次，合并上清液，并調(diào)pH4.3沉淀去除球蛋白，得到小黑豆乳清蛋白濾液。該濾液經(jīng)高真空濃縮后，分為兩部分，并分別在65℃和75℃微波加熱10min，得到抗腫瘤實(shí)驗(yàn)所用的65℃處理蛋白和75℃處理蛋白。經(jīng)凝膠色譜分析乳清蛋白，得知其中胰蛋白酶抑制劑Kunitz和Bowman-Birk二者占乳清總蛋白的68%。

1.3.2 小黑豆中TI活性降低率的測(cè)定

采用改良的ISO 14902:2001《動(dòng)物飼料——大豆制品胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)[4]。取10mL具塞玻璃離心管，按照以下方法加入溶液：1)標(biāo)準(zhǔn)空白：5mL BAPNA溶液，3mL去離子水，1mL 5.3mol/L醋酸；2)標(biāo)準(zhǔn)溶液：5mL BAPNA 溶液，3mL去離子水；3)樣品空白：5mL BAPNA 溶液，1mL樣品稀釋液，2mL去離子水，1mL 5.3mol/L醋酸；4)樣品溶液：5mL BAPNA溶液，1mL樣品稀釋液，2mL去離子水。充分混勻，于37℃水浴鍋中保溫10min。然后各管均加入1mL胰蛋白酶工作液，混勻，繼續(xù)保溫10min±5s，于2)管和4)管中分別加入1mL 5.3mol/L醋酸終止反應(yīng)。充分混合上述溶液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)410nm處測(cè)定溶液吸光度(用標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)零)。該溶液能夠至少2h保持穩(wěn)定。

加熱處理后，乳清蛋白中TI活性降低率的計(jì)算方法[5]為：

式中：ΔA1是加熱處理后的乳清測(cè)得的吸光度與酶液的吸光度之差；ΔA2是原小黑豆乳清液測(cè)得的吸光度與酶液的吸光度之差。

1.3.3 S180腫瘤小鼠模型的建立

在無菌條件下抽取腹腔保種10d的小鼠S180細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為3.0×107個(gè)/mL。除基礎(chǔ)組外，每只小鼠右腋皮下接種0.2mL腫瘤細(xì)胞懸液。

1.3.4 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)過程

動(dòng)物接種S180腫瘤后24h，隨機(jī)分為基礎(chǔ)組、腫瘤模型組、環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組，65℃和75℃蛋白高、低劑量組共7組，每組10只小鼠。各高、低劑量蛋白組分別按10、3g/(kg·d)喂食(以乳清中的蛋白的質(zhì)量/體質(zhì)量計(jì))，陽性對(duì)照組腹腔注射環(huán)磷酰胺20mg/(kg·d)。實(shí)驗(yàn)期為14d。實(shí)驗(yàn)第9天，用DNCB致敏各組動(dòng)物(除基礎(chǔ)組)；第10天，對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行SRBC血清溶血素實(shí)驗(yàn)。14d實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定小鼠瘤徑、白細(xì)胞數(shù)量、免疫器官指數(shù)、耳腫脹度和血清半數(shù)溶血值等生化指標(biāo)。

1.3.5 免疫器官指數(shù)及白細(xì)胞數(shù)測(cè)定

各組動(dòng)物連續(xù)給藥14d后24h，稱體質(zhì)量并測(cè)量腫瘤直徑，眼眶取血計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。之后處死動(dòng)物，剝離腫瘤、胸腺、脾臟等組織，用濾紙吸干后稱其質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率、瘤與體質(zhì)量比和各臟器指數(shù)[6]。

式中：d1、d2、d3為腫瘤3個(gè)互相垂直的直徑/mm。

1.3.6 細(xì)胞免疫-遲發(fā)型免疫變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)[7]

實(shí)驗(yàn)第9天，除基礎(chǔ)組外各組小鼠用脫毛劑脫毛腹部皮膚，面積約3cm×3cm，用1% DNCB溶液50μL均勻涂抹于脫毛處致敏。第14天用1% DNCB溶液10μL攻擊小鼠右耳?；A(chǔ)組同樣涂耳，攻擊24h后，頸椎脫臼處死，剪下左右耳殼，用R8mm打孔器取耳片稱質(zhì)量，以左右耳片質(zhì)量之差為腫脹度。

1.3.7 體液免疫-血清溶血素實(shí)驗(yàn)[8]

參照文獻(xiàn)[8]中方法制備綿羊紅細(xì)胞(SRBC)和補(bǔ)體制備。實(shí)驗(yàn)第10天，用生理鹽水將壓積SRBC配成2%的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL進(jìn)行免疫。

第14天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24h，摘眼球取血，收集血清。每份血清用生理鹽水稀釋200倍，取稀釋血清1mL置試管內(nèi)，依次加入10% SRBC 0.5mL、10%補(bǔ)體1mL，另設(shè)不加血清的空白對(duì)照管(血清用生理鹽水代替)?；旌虾?7℃恒溫箱保溫30min，置冰浴中終止反應(yīng)。2000r/min離心取上清液1mL，加都氏試劑3mL；同時(shí)取10% SRBC 0.25mL，加都氏試劑至4mL與另一試管內(nèi)(該管測(cè)定的OD值即為SRBC半數(shù)溶血值)，充分混勻，放置10min后，于波長(zhǎng)540nm處以空白對(duì)照管調(diào)零，分別測(cè)定各管光密度值。按式(8)計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組半數(shù)溶血值HC50。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用±s表示，用SPSS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱對(duì)小黑豆乳清中TI活性的影響

小黑豆乳清蛋白經(jīng)65℃、10min微波處理后，TI活力降低率為30.2%；經(jīng)75℃、10min微波處理后，小黑豆TI活力降低率為55.0%。由此可見，小黑豆乳清蛋白經(jīng)65℃和75℃處理，TI均有所下降，且前者小于后者。

2.2 小黑豆乳清蛋白對(duì)S180腫瘤的抑制作用

表1 小黑豆乳清蛋白對(duì)S180腫瘤的抑制作用(±s，n=10)Table 1 Effect of whey protein from small black soybean on S180 tumor growth in vivo(±s，n=10)

表1 小黑豆乳清蛋白對(duì)S180腫瘤的抑制作用(±s，n=10)Table 1 Effect of whey protein from small black soybean on S180 tumor growth in vivo(±s，n=10)

注：a.與模型組相比，差異顯著(P＜0.05)；b.與模型組相比，差異極顯著(P＜0.01)； c.與65℃同劑量蛋白組相比差異顯著(P＜0.05)。下同。

組別 平均瘤直徑/mm 瘤與體質(zhì)量的比/% 抑瘤率/%模型組 1.81±0.14 4.52±0.68陽性對(duì)照組 1.57±0.11b 2.13±0.91b 72.9 65℃蛋白高劑量組 1.56±0.04b 2.67±0.66b 35.8 65℃蛋白低劑量組 1.69±0.08a 3.82±1.02a 14.3 75℃蛋白高劑量組 1.46±0.03b 2.08±0.71bc 41.8 75℃蛋白低劑量組 1.53±0.06bc 2.93±0.88bc 20.5

由表1可見，與模型組相比，對(duì)于平均瘤徑和瘤與體質(zhì)量比兩項(xiàng)指標(biāo)來說，陽性對(duì)照組、75℃蛋白高、低劑量組和65℃蛋白高劑量組降低極顯著(P＜0.01)；65℃蛋白低劑量組降低顯著(P＜0.05)。各組抑瘤率順序?yàn)椋宏栃詫?duì)照組＞75℃蛋白高劑量＞65℃蛋白高劑量＞75℃蛋白低劑量＞65℃蛋白低劑量組。比較75℃和65℃同劑量蛋白組可見，在相同攝入劑量時(shí)，前者的瘤與體質(zhì)量比明顯低于后者(P＜0.05)。

2.3 小黑豆乳清蛋白對(duì)臟器指數(shù)的影響

由表2可見，各實(shí)驗(yàn)組胰臟指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，說明經(jīng)65℃和75℃處理的小黑豆乳清蛋白對(duì)小鼠胰腺無明顯影響，無致胰腺腫大作用?；A(chǔ)組的肝臟指數(shù)顯著低于模型組和各實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，說明腫瘤移植會(huì)使小鼠的肝臟指數(shù)增加。胸腺和脾臟是機(jī)體的重要免疫器官，其結(jié)構(gòu)的正常與否直接影響機(jī)體的免疫功能。與模型組相比，陽性對(duì)照組的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)降低極顯著(P＜0.01)，說明環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠這兩個(gè)免疫器官有明顯的抑制作用。而75℃蛋白高、低劑量?jī)山M的胸腺指數(shù)與其他各組相比明顯提高(P＜0.05)，與基礎(chǔ)組處于同一水平。說明75℃處理組對(duì)荷瘤小鼠的免疫器官有明顯促進(jìn)作用，其效果好于65℃處理組。

表2 小黑豆乳清蛋白對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of whey protein from small black soybean on organ index of S180-bearing mice(±s，n=10)

表2 小黑豆乳清蛋白對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of whey protein from small black soybean on organ index of S180-bearing mice(±s，n=10)

肝臟指數(shù)/(mg/g)基礎(chǔ)組 7.42±1.79 0.98±0.32a 12.93±1.01 49.19±5.70a模型組 6.23±0.51 0.70±0.10 13.27±0.82 52.48±1.89陽性對(duì)照組 4.43±0.43b 0.45±0.03b 12.88±1.16 50.23±5.51 65℃蛋白高劑量組 6.97±1.43 0.82±0.16 12.90±0.61 53.68±0.40 65℃蛋白低劑量組 6.77±1.44 0.71±0.08 13.00±0.76 52.23±0.93 75℃蛋白高劑量組 7.96±1.84 1.08±0.04a 12.76±0.84 50.91±2.35 75℃蛋白低劑量組 6.82±0.59 0.93±0.20a 12.92±0.56 50.91±2.35組別 脾臟指數(shù)/(mg/g)胸腺指數(shù)/(mg/g)胰臟指數(shù)/(mg/g)

2.4 小黑豆乳清蛋白對(duì)免疫細(xì)胞及免疫功能的影響

表3 小黑豆乳清蛋白對(duì)小鼠免疫細(xì)胞及免疫功能的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of whey protein from small black soybean on the immune cells and immune function of S180-bearing mice(±s，n=10)

表3 小黑豆乳清蛋白對(duì)小鼠免疫細(xì)胞及免疫功能的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of whey protein from small black soybean on the immune cells and immune function of S180-bearing mice(±s，n=10)

(106個(gè)/mL) 腫脹度/% 半數(shù)溶血值HC50基礎(chǔ)組 12.4±3.3b 19.5±2.67b 119.74±5.54b模型組 5.15±1.78 16.73±0.88 99.87±3.77陽性對(duì)照組 6.00±2.16 18.26±1.14b 119.20±2.95b 65℃蛋白高劑量組 9.67±0.58b 17.15±0.99a 113.04±5.59b 65℃蛋白低劑量組 7.12±1.32a 17.06±0.91a 109.27±2.76b 75℃蛋白高劑量組 13.50±1.11bc 19.43±0.49bc 121.18±5.43bc 75℃蛋白低劑量組 9.07±0.81bc 18.97±1.77bc 115.87±7.93bc組別 白細(xì)胞數(shù)/

由表3可見，各實(shí)驗(yàn)組血清溶血素值都比模型組極顯著提高(P＜0.01)；模型組的白細(xì)胞數(shù)、腫脹度和半數(shù)溶血值都顯著低于基礎(chǔ)組(P＜0.01)，免疫損傷最大。75℃蛋白高劑量組的白細(xì)胞數(shù)等3項(xiàng)免疫指標(biāo)與基礎(chǔ)組處于同一水平，免疫調(diào)節(jié)效果最好。與模型組比，陽性對(duì)照組小鼠的白細(xì)胞無顯著增加(P＞0.05)，65℃蛋白高、低劑量組顯著升高(P＜0.05)，75℃各實(shí)驗(yàn)組升高極顯著(P＜0.01)。陽性對(duì)照組和75℃蛋白高、低劑量組小鼠的耳殼腫脹度與模型組相比增加極顯著(P＜0.01)，65℃蛋白高、低劑量組的腫脹度增加顯著(P＜0.05)，說明各實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞免疫功能下降有顯著抑制作用。75℃和65℃同劑量蛋白組對(duì)比，白細(xì)胞數(shù)、耳殼腫脹度和血清半數(shù)溶血值3個(gè)指標(biāo)均存在顯著差異(P＜0.05)，反映在小鼠的非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫方面，均為75℃處理組優(yōu)于65℃處理組。

3 討 論

有研究認(rèn)為，TI有抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性、降低蛋白質(zhì)消化吸收等抗?fàn)I養(yǎng)作用，并可致胰腺腫大或引發(fā)炎癥，但低濃度的TI具有降低癌癥發(fā)病率的作用[9-10]。一般認(rèn)為，當(dāng)一種受試物使腫瘤小鼠的抑瘤率達(dá)到30%以上時(shí)，表明該受試物可以有效抑制腫瘤生長(zhǎng)[11]。但是本實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)，含TI 68%的小黑豆乳清蛋白如果不經(jīng)熱處理，在低于1.5g/kg攝入劑量時(shí)的抗腫瘤效果不顯著；高于3g/kg劑量時(shí)抗腫瘤效果雖好，但會(huì)致動(dòng)物胰腺腫大。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)含TI 68%的小黑豆乳清蛋白75℃和65℃處理后，以3g/(kg·d)和10g/(kg·d)的劑量喂食小鼠，結(jié)果表明，小黑豆乳清蛋白在75℃和65℃處理后，TI活力分別降低了55.0%和30.2%，TI抗?fàn)I養(yǎng)性降低了，喂食小鼠后胰臟指數(shù)與基礎(chǔ)組相比無明顯差異；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，相同劑量條件下，所有75℃蛋白處理組的抑瘤率均優(yōu)于65℃蛋白組，75℃和65℃處理組的S180抑瘤率分別為41.8%、35.8%。因此，從降低抗?fàn)I養(yǎng)性和保持TI的較高抗腫瘤活性的角度看，用75℃處理乳清蛋白效果較好，而該溫度處理后抗腫瘤效果優(yōu)于65℃處理的原因可能是，75℃處理使乳清蛋白中TI的構(gòu)型改變適度，使具有增強(qiáng)免疫或抗腫瘤活性基團(tuán)的外展比65℃處理更充分[12]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤移植會(huì)使小鼠的肝臟指數(shù)增加，可能是腫瘤細(xì)胞的繁殖對(duì)肝臟產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞代償性增生同時(shí)伴隨肥大[13]，從而使小鼠肝臟質(zhì)量增加。胸腺、脾臟是重要的免疫器官，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，75℃蛋白組的胸腺指數(shù)與65℃蛋白組及模型組相比明顯提高，這可能與小黑豆乳清蛋白在75℃處理后抗氧化能力提高及對(duì)機(jī)體的保護(hù)性提高有關(guān)。而各實(shí)驗(yàn)溫度和劑量的蛋白組動(dòng)物的脾臟指數(shù)與基礎(chǔ)組相比無顯著差異，說明小黑豆乳清蛋白對(duì)小鼠免疫器官無明顯抑制作用。而環(huán)磷酰胺陽性組小鼠的胸腺和脾臟器官都受到顯著的抑制。在相同劑量時(shí)，75℃處理組抑制荷瘤小鼠各項(xiàng)免疫功能下降的作用也明顯好于65℃處理，且呈一定的量效關(guān)系，與抑瘤率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，因此小黑豆乳清蛋白抗腫瘤作用可能是通過增強(qiáng)免疫細(xì)胞、免疫分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力并防止腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，調(diào)動(dòng)和增強(qiáng)動(dòng)物抗腫瘤免疫活性；或者是通過增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫能力，起到間接抑制S180腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。至于熱處理溫度對(duì)乳清蛋白分子結(jié)構(gòu)的變化及作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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