灰葉馬尾藻多糖的提取及其生物活性

劉 芳，鄭育聲，尹學(xué)瓊,*，沈 琦，楊冬云

(1.海南大學(xué) 海南省精細(xì)化工工程研究中心，海南 海口 570228；2.海南惠普森醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司，海南 ?？?570216)

多糖是由同種單糖或不同種單糖通過(guò)糖苷鍵結(jié)合而成的天然大分子碳水化合物，普遍存在于高等植物、細(xì)菌、真菌、藻類(lèi)和動(dòng)物體內(nèi)，自然資源豐富。天然多糖不僅對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用，而且具有提高免疫、抗病毒、抗輻射、抗癌、降血糖、減肥和抗氧化等作用[1-5]。海洋中的海藻、蝦蟹殼、微生物等蘊(yùn)含著極其豐富的甲殼素、硫酸多糖、肝素等活性多糖，是開(kāi)發(fā)海洋生物多糖保健食品和多糖藥物、尋找新型多糖藥物先導(dǎo)化合物的寶貴資源[6-8]。

灰葉馬尾藻(Sargassum cinereum)，隸屬褐藻門(mén)、墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬，主要分布于我國(guó)東海、南海沿岸[9]，由于其可食性差，目前開(kāi)發(fā)利用度較低，對(duì)其有效成分研究較少。本研究采用NaOH水溶液對(duì)海南產(chǎn)灰葉馬尾藻進(jìn)行多糖提取純化、結(jié)構(gòu)分析及生物活性測(cè)定，以期為開(kāi)發(fā)海南特色海藻資源提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰葉馬尾藻采自海南省南燕灣，經(jīng)海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院劉美華副教授鑒定，確定為灰葉馬尾藻。海藻經(jīng)洗凈曬干后，剪成0.5cm碎片裝入塑料袋備用?？拱┗钚詼y(cè)定中所用細(xì)胞為人前髓性白血病細(xì)胞(HL60)。

CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 日本Dojindo公司；NaOH、無(wú)水乙醇、NaCl、硫酸、鹽酸、氯仿、正丁醇中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；DEAE-32纖維素 北京索萊寶科技有限公司；葡聚糖凝膠SephadexG-75 美國(guó)Pharmacia公司；瓊脂糖、溴酚藍(lán)、硫酸亞鐵、5,5-二甲基-吡咯啉-N-氧化物(DMPO) 阿拉丁試劑(中國(guó))有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1E冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；T6新銳可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ3200B超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；Paragon 1000傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)PE公司；1515GPC凝膠滲透色譜 美國(guó)Waters公司；A320電子自旋共振儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取與純化

稱(chēng)取2g灰葉馬尾藻碎片，加入80mL NaOH水溶液(質(zhì)量濃度分別為1、2、3g/100mL)，80℃超聲1h，再在80℃恒溫水浴4h，抽濾，取上清液濃縮。用2% HCl調(diào)pH值至4，4℃靜置過(guò)夜。離心，沉淀用20mL超純水溶解，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加入20.0mL Sevag去蛋白質(zhì)試劑(氯仿、正丁醇體積比為4∶1的混合液)，劇烈振搖15min，靜置30min，棄去有機(jī)溶劑層和蛋白質(zhì)層，再加入20.0mL Sevag試劑。重復(fù)以上操作，直至其水溶液用紫外光譜儀檢測(cè)不到蛋白質(zhì)為止。在去蛋白后的溶液中加入50mL無(wú)水乙醇，4℃靜置過(guò)夜。離心，沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮洗滌，真空干燥得產(chǎn)品[10]。

取0.3g灰葉馬尾藻多糖樣品溶于20mL水中，注入DEAE-32纖維素離子交換柱(2.6cm×60cm)，分別用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mol/L NaCl溶液洗脫，洗脫體積流量為2mL/min，每管收集4mL，以苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量，收集、濃縮、透析，冷凍干燥，得純多糖[11]。

1.3.2 結(jié)構(gòu)分析

將各待測(cè)樣品及0.1%溴酚藍(lán)指示劑于瓊脂糖電泳(厚度約為3mm，7cm×9cm)負(fù)極端點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為5μL，置于電泳槽中；加入電極緩沖液，于電壓10V/cm進(jìn)行電泳。觀察指示劑移動(dòng)情況，待指示劑行至距凝膠前沿約1.5～2cm處，停止電泳。剝?nèi)∧z，置甲苯胺藍(lán)染色液染色10min，用水脫色[12]。

將多糖溶解在水中，以凝膠滲透色譜測(cè)試分子質(zhì)量分布情況，測(cè)試條件如下：檢測(cè)器：示差檢測(cè)器；流動(dòng)相：0.05%疊氮化鈉水溶液；流速：0.6mL/min；柱溫：55℃；檢測(cè)器溫度：50℃；柱子填料：葡聚糖；柱子型號(hào)：UtrahydrogelTM500、UtrahydrogelTM120雙柱串聯(lián)。以葡聚糖系列多糖標(biāo)定色譜柱[13]。

分別取各濃度淋洗得到的精多糖樣品少量，KBr壓片，在4000～400cm-1波數(shù)處，用Paragon 1000傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行掃描。

1.3.3 抗羥自由基(·OH)活性測(cè)試

將50μL 1%多糖樣品或者作為對(duì)照的等體積的雙蒸水，50μL 0.05mol/L的PBS溶液(pH7.4)加入到50μL 0.3mol/L DMPO溶液和10mmol/L FeSO4溶液，再加入50μL 10mmol/L H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，將反應(yīng)體系吸入密封的毛細(xì)管中。2.5min后用ESR光譜儀記錄ESR圖譜。測(cè)試條件為：中心磁場(chǎng)(CF)：3512.3G；掃描寬度(SW)：200G；掃描時(shí)間(ST)：15.36s；調(diào)制幅度(MA)：3.0G；調(diào)制頻率：100kHz；微波頻率：9.863GHz；微波功率：20.0mW；測(cè)試溫度：室溫[14]。

多糖溶液對(duì)·OH的清除作用以清除率表示，計(jì)算公式為：

式中：H0和HX分別為樣品不添加和添加多糖時(shí)ESR圖譜第2峰信號(hào)強(qiáng)度(高度)。

1.3.4 抗癌活性測(cè)定[15]

藥物溶解：用滅菌PBS溶解SP1和SP2，總質(zhì)量濃度為50μg/μL，稀釋至10μg/μL，備用。

細(xì)胞接板：設(shè)置0、24、48、72h 4個(gè)檢測(cè)時(shí)間。在96孔板中每孔接種10×104個(gè)HL60細(xì)胞，之后，在每孔中分別加入9μL以上2種藥物，使其終質(zhì)量濃度達(dá)到900μg/μL，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至各設(shè)定檢測(cè)時(shí)間。

細(xì)胞生長(zhǎng)情況檢測(cè)：96孔板測(cè)定孔中加入10μL CCK-8，分別于450nm和600nm(參比波長(zhǎng))處測(cè)定光密度(OD)值，樣品OD值為OD450nm－OD600nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰葉馬尾藻多糖的產(chǎn)率

采用NaOH水溶液提取灰葉馬尾藻多糖，通過(guò)Sevag法脫蛋白、DEAE-纖維素柱層析進(jìn)行多糖純化。以0.2、0.4、0.6、0.8mol/L NaCl淋洗DEAE-纖維素柱，0.2mol/L NaCl溶液洗脫得樣品SP1，產(chǎn)量為總上樣量的46.2%；0.4mol/L NaCl溶液洗脫得樣品SP2，產(chǎn)量為總上樣量的41.1%；其他濃度的NaCl溶液洗脫得到的樣品量太少，無(wú)法收集分析。

當(dāng)提取溫度80℃、提取時(shí)間4h、NaOH的質(zhì)量濃度為1、2、3g/100mL時(shí)，脫蛋白未過(guò)柱的粗多糖的產(chǎn)率分別為9.6%、13.4%、11.0%。

2.2 灰葉馬尾藻多糖的理化性質(zhì)

經(jīng)冷凍干燥后的SP1、SP2均呈淺黃色海綿狀，易溶于熱水，不溶于無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑。SP1、SP2的水溶液均為透明的黏稠狀淺黃色液體，苯酚-硫酸顯色反應(yīng)陽(yáng)性。對(duì)SP1、SP2水溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在260、280nm波長(zhǎng)處的核酸和蛋白質(zhì)特征吸收峰，說(shuō)明提取的多糖基本不含多肽和蛋白質(zhì)[11]。

2.3 瓊脂糖電泳結(jié)果

圖1 灰葉馬尾藻粗多糖的瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agarose electrophoresis of SP1 and SP2

采用瓊脂糖電泳法對(duì)所得的多糖純度及荷電性進(jìn)行檢驗(yàn)，如圖1所示。SP1、SP2都帶負(fù)電荷，圖中SP1、SP2均為單一均勻連續(xù)帶，表明SP1、SP2所帶電荷數(shù)相近，且SP1譜帶比SP2寬，即SP1分子質(zhì)量分布較寬。

2.4 凝膠滲透色譜(GPC)結(jié)果

圖2 多糖分子質(zhì)量分布GPC圖Fig.2 GPC curves of SP1 and SP2

多糖分子質(zhì)量及化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)其性能具有重要影響作用[16-17]，本實(shí)驗(yàn)采用GPC對(duì)SP1、SP2分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量。由圖2可知，SP1、SP2均為較單一峰，但是SP1分子質(zhì)量分布很寬，而SP2分子質(zhì)量分布較窄。由表1可知，SP1數(shù)均分子質(zhì)量約36kD，分子質(zhì)量分散系數(shù)為1.79；SP2數(shù)均分子質(zhì)量約為77kD，分子質(zhì)量分散系數(shù)為1.29。GPC分析結(jié)果與電泳結(jié)果一致。

表1 灰葉馬尾藻多糖分子質(zhì)量分布情況Table 1 Molecular weight distribution of SP1 and SP2

2.5 紅外光譜分析結(jié)果

為了證實(shí)SP1、SP2中有羧基存在，對(duì)由NaOH溶液提取所得SP1、SP2(稱(chēng)為堿式糖)進(jìn)行酸化處理，將SP1與SP2溶解后，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值到4，再用分子質(zhì)量3500D的透析袋透析，冷凍干燥得SP1a與SP2a (稱(chēng)為酸式糖)。由圖3～4可知，SP1、SP2具有相似的紅外譜圖，在3400～3450cm-1間處出現(xiàn)一寬峰，為O—H的伸縮振動(dòng)，表明多糖存在分子間和分子內(nèi)氫鍵；2920～2935cm-1處的吸收峰較弱，為C—H伸縮振動(dòng)[18]；1250.7cm-1處出現(xiàn)硫酸基(—O-SO)中S—O的伸縮振動(dòng)峰，表明樣品為硫酸多糖。在SP1a、SP2a的圖譜上，1615cm-1為—C=O(—COONa)對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，酸化后該峰明顯減弱，在1737.0cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，表明—COONa轉(zhuǎn)化成了—COOH。1035～1045cm-1處為吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的C—O吸收峰，該吸收峰的存在說(shuō)明樣品主要為吡喃多糖，805～820cm-1是α-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰[18]。

圖3 SP1的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of SP1

圖4 SP2的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of SP2

2.6 抗氧化活性

圖5 灰葉馬尾藻多糖清除?OH活性Fig.5 Hydroxyl radical-scavenging capacity of SP1 and SP2

由圖5可知，10mg/mL的SP1和SP2都有非常明顯的清除?OH活性，其中SP1清除率為87.2%，SP2清除率為61.5%(具體計(jì)算數(shù)據(jù)未顯示)；降低多糖質(zhì)量濃度至1mg/mL，SP1和SP2對(duì)?OH清除活性變化，SP1清除率為18.8%，SP2清除率為67.1%(具體計(jì)算數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)對(duì)比可以看出，SP1由10mg/mL稀釋到1mg/mL后，對(duì)?OH的清除作用明顯減弱，而SP2由10mg/mL稀釋到1mg/mL后，對(duì)?OH的清除活性反略有升高。SO42－和糖醛酸的含量對(duì)?OH的清除作用影響明顯，低硫高糖醛酸組分對(duì)?OH的清除活性更好一些[19]。有些多糖對(duì)?OH的清除能力，是在一定范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，但超過(guò)某一質(zhì)量濃度后，對(duì)?OH的清除能力隨質(zhì)量濃度的升高反而降低[20]。

2.7 抗癌活性測(cè)定結(jié)果

圖6 SPI和SP2對(duì)HL60細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of SP1 and SP2 on the growth of HL60 cells

由圖6可知，從接種到72h培養(yǎng)過(guò)程中，空白組OD值不斷升高，說(shuō)明HL60細(xì)胞正常生長(zhǎng)，累計(jì)數(shù)量逐漸增多。而添加SP1和SP2的2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，其OD值增加不大，表明SP1和SP2均具有較強(qiáng)的抑制HL60細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，SP2抑制活性更高。SP1和SP2發(fā)揮抑制白血病細(xì)胞作用的時(shí)間約在接觸細(xì)胞24h后，在48h時(shí)抑制作用最為明顯。

3 結(jié) 論

采用NaOH水溶液對(duì)灰葉馬尾藻進(jìn)行超聲浸提，柱層析得到2種純度較高的水溶性灰葉馬尾藻多糖SP1、SP2，對(duì)所得多糖進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)分析，并測(cè)定SP1、SP2的抗氧化和抗癌活性。體外抗氧化測(cè)定表明，SP1和SP2均具有良好抗氧化活性，且隨質(zhì)量濃度降低，SP1對(duì)?OH的清除率下降，SP2的清除率反而升高，該反應(yīng)的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。體外抗癌測(cè)試結(jié)果揭示SP1和SP2均具有較強(qiáng)的抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)活性，其作用機(jī)制也有待深入探討?；胰~馬尾藻多糖含量高、提取工藝簡(jiǎn)單、生物活性高，在開(kāi)發(fā)海洋多糖類(lèi)藥物方面具有良好應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)價(jià)值。

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