草魚肌肉蛋白質(zhì)在冷藏過程中的變化

李 強，劉永樂*，王發(fā)祥，王滿生，俞 健，李向紅，王建輝

(長沙理工大學食品與生物工程系，湖南 長沙 410014)

草魚(Ctenopharyngodon idellus)又名鯇魚，屬鯉形目、鯉科、草魚屬，作為我國“四大家魚”之首，不僅食用品質(zhì)良好，而且鮮銷價格適中，深受消費者歡迎[1]。草魚肌肉水分含量高約80%、蛋白質(zhì)含量約18%、脂肪含量約3%，是一種典型的高蛋白低脂肪食品，在貯藏、運輸、加工處理及銷售過程中極易發(fā)生腐敗[2-4]，提高其貯藏性和貨架期一直是一個重要的課題。蛋白質(zhì)是魚類肌肉組織的主要組成成分之一，其降解、聚合和變性都會導致蛋白質(zhì)功能的喪失，從而直接決定魚類肌肉質(zhì)量的好壞。因此，在草魚肉的冷藏過程中，蛋白質(zhì)的降解和生化變化往往是魚肉鮮度下降、軟化并最終發(fā)生腐敗的重要原因之一。

目前，國內(nèi)外對肌肉蛋白質(zhì)研究較多的淡水魚主要是鱸魚和鰱魚，且大都集中于蛋白質(zhì)的提取工藝、冷凍變性等方面，對其在貯藏過程中的變化研究較少[5-8]?，F(xiàn)階段，研究者們多熱衷于對草魚保鮮技術(shù)方面的研究，往往忽視了有關草魚貯藏過程中的一些深層次生理生化變化，特別是對其肌肉蛋白質(zhì)在貯藏過程中的變化規(guī)律研究不多或了解甚少，因而盡管多種保鮮新技術(shù)[9-12]層出不窮，但仍無法有效阻止草魚肉的鮮度下降和腐敗。本實驗以新鮮草魚為原料，研究草魚肌肉蛋白質(zhì)在冷藏過程中的組成特性變化，從蛋白質(zhì)變化角度闡述草魚肉在貯藏過程中鮮度變化機理，旨在為針對性開展新鮮草魚的保鮮及開發(fā)相應產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮草魚購自當?shù)厥袌?，每尾約1.5kg。

標準蛋白 加拿大Fermentas公司；牛血清蛋白上海澤龍生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

UV-2100紫外分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；5430R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；JYL-C012絞肉機 九陽股份有限公司；DYCZ-24DN電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 魚肉樣品制備

鮮活草魚于冰水中暫養(yǎng)1～2h，放血后去頭、鱗和內(nèi)臟，用預冷水清洗干凈后剔除魚骨，將背部肌肉分割成大小均勻的小塊(約25g)，置于4℃冰箱中，備用。分別取冷藏時間為0、2、4、6、8、10d的魚塊于絞肉機內(nèi)絞碎，即為實驗魚肉樣品。

1.2.2 不同溶解性蛋白質(zhì)含量的測定

取一支50mL的離心管，精確稱取約2g 樣品(精確至0.01g)，加入蒸餾水18mL，均質(zhì)1min，25℃浸提1h，5000×g離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，重復操作1次，合并上清液，并定容至50mL，所得樣品即為水溶性蛋白溶液。如此將沉淀依次用鹽(0.5mol/L NaCl溶液)、酸(pH 2.0鹽酸溶液)、堿(pH12 NaOH溶液)浸提，所得上清液即分別為鹽溶性蛋白、酸溶性蛋白、堿溶性蛋白。以微量凱氏定氮法測定其蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)含量的測定

參考Hashimo等[13]的方法，并稍作修改。精確稱取約2g樣品(精確至0.01g)與20mL磷酸鹽緩沖液A(含15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5mmol/L NaH2PO4，pH7.5)混合，均質(zhì)20s左右，浸提0.5h，5000×g離心15min，沉淀加入20mL磷酸緩沖液A(含0.5mol/L NaCl)，重復上述操作，將2次離心后的上清液合并，加入三氯乙酸(TCA)，使TCA的終濃度達50g/L后離心，所得沉淀即為肌漿蛋白樣品。經(jīng)緩沖液A提取2次后所得的沉淀中加入20mL磷酸鹽緩沖液B，均質(zhì)20s左右，浸提0.5h，5000×g離心15min，再在沉淀中加入20mL磷酸鹽緩沖液B，重復上述操作，將2次離心后的上清液合并，即為肌原纖維蛋白樣品。在沉淀中加入0.1mol/L NaOH溶液，均質(zhì)，浸提2h，5000×g離心15min，所得沉淀即為肌基質(zhì)蛋白樣品。肌原纖維蛋白采用雙縮脲法進行定量測定；肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白則采用微量凱氏定氮法測定。

1.2.4 肌肉中總蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析

準確稱取肌肉樣品2g(精確至0.01g)，加入20mL 20g/L SDS的溶液，均質(zhì)，浸提0.5h，5000×g離心15min，收集上清液；準確吸取上清液200μL于1.5mL Eppendorf管中，加入等體積的上樣緩沖液，于沸水中煮沸5min，然后10000×g離心5min，所得上清液即為待電泳樣品。電泳用分離膠濃度為12%，采用恒流23mA進行電泳分離。用0.5g/L的考馬斯亮藍R250染色2～3h，然后脫色至背景透明，照相并分析電泳條帶[14-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚肌肉冷藏過程中不同溶解性蛋白質(zhì)含量的變化

圖1 草魚肌肉冷藏過程中不同溶解性蛋白質(zhì)含量的變化Fig.1 Change in contents of proteins with different solubility during chill storage of grass carp muscle

由圖1可知，冷藏前4d，水溶性和酸溶性蛋白含量基本未變，鹽溶性蛋白含量稍有減少，堿溶性蛋白含量略有增加，可能是因為冷藏前期微生物作用受到抑制，肌肉組織內(nèi)源酶的作用對蛋白質(zhì)的降解有限。隨著冷藏時間的繼續(xù)延長，水溶性蛋白含量顯著增加，鹽溶性蛋白含量也明顯上升，但酸溶性和堿溶性蛋白含量在逐漸降低，這可能是因為冷藏4d后，一方面內(nèi)源組織酶持續(xù)作用于肌肉蛋白質(zhì)的效果得以積累，另一方面微生物繁殖和活動引入大量外源性蛋白酶，從而導致大分子蛋白質(zhì)組分持續(xù)降解，從而改變了其溶解性。此外，冷藏第8天后，鹽溶性蛋白含量明顯減少，可能是因為此時酸、堿溶性蛋白組分已基本徹底降解，不再或很少轉(zhuǎn)變?yōu)辂}溶性部分，但鹽溶性蛋白還在繼續(xù)變化為水溶性蛋白。

2.2 草魚肌肉冷藏過程中不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的變化

魚肌肉蛋白質(zhì)可以分為肌原纖維蛋白(約占60%～75%)、肌漿蛋白(約占20%～35%)和肌基質(zhì)蛋白(約占2%～5%)3類[18]。冷藏過程中草魚肌肉中3類不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的含量變化情況如圖2所示。可見，冷藏前4d，3類蛋白質(zhì)的含量變化較??；至第4天后，肌原纖維蛋白含量開始顯著降低，但肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白僅稍有下降，說明冷藏過程中，發(fā)生降解的蛋白質(zhì)組分主要是肌原纖維蛋白，如肌球蛋白等。實際上，肌原纖維蛋白的數(shù)量和完整性(分子大小分布)與魚肉的質(zhì)構(gòu)、彈性、持水力及所有與其品質(zhì)有關的特征直接相關，而冷藏過程中內(nèi)、外源蛋白酶和許多代謝性蛋白質(zhì)的作用加速了其降解，從而導致魚肉軟化和腐敗[19]。

圖2 草魚肌肉冷藏過程中不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)含量變化Fig.2 Changes in contents of proteins with different structure during chill storage of grass carp muscle

圖3 草魚肌肉冷藏過程中各蛋白質(zhì)含量變化幅度Fig.3 Reduction in contents of different molecular proteins during chill storage of grass carp muscle

由圖3可知，草魚肌肉冷藏過程中3類不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)在冷藏過程中一直在降解，但相對于肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白，肌原纖維蛋白隨著冷藏時間的延長，其含量下降的程度越明顯，這除了肌肉組織蛋白酶主要作用于肌原纖維蛋白外，也可能與其含量占整個肌肉蛋白質(zhì)比例最大有關。同時也說明隨著冷藏時間的延長，草魚肌肉組織蛋白質(zhì)降解程度增加，魚肉鮮度下降或腐敗現(xiàn)象越嚴重。

2.3 草魚肌肉冷藏過程中肌肉總蛋白的SDS-PAGE分析

圖4 草魚肌肉冷藏過程中總蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE pattern of total muscular proteins in grass carp during chill storage of grass carp muscle

由圖4可知，新鮮草魚樣品(0d)在SDS-PAGE圖譜上可清晰分辨出20～30條蛋白帶，其中主要條帶為肌球蛋白重鏈(MHC，210kD)、肌動蛋白(actin，42kD)、原肌球蛋白(α-或β-tropomyosin，35kD)以及3種肌球蛋白輕鏈(MLC，15、17、24kD)，另外還有一些分子質(zhì)量20～40kD間的明顯蛋白條帶。冷藏 2d 后，所有蛋白條帶的信號較 0d 的樣品均有所下降，表明冷藏過程中各種蛋白質(zhì)均會降解；冷藏第8天時，210kD的肌球蛋白重鏈等大分子蛋白條帶幾乎完全消失，分子質(zhì)量為17、15kD的肌球蛋白輕鏈(MLC2和MLC3)及其他小分子蛋白條帶也基本消失，表明這些蛋白在冷藏后期極易降解。有趣的是，冷藏第8天后的泳道新增了一條大于85kD的新蛋白條帶，可能為大分子蛋白質(zhì)降解后的中間體，也可能為某些小分子蛋白質(zhì)的寡聚體?？梢姡?2kD的肌動蛋白和24kD的肌球蛋白輕鏈(MLC1)相對比較穩(wěn)定，10d時仍有明顯的條帶存在，但降解仍超過50%。此外，部分30～40kD的蛋白質(zhì)如原肌球蛋白似乎比較穩(wěn)定，冷藏10d其蛋白條帶的信號變化不明顯，這與張凌晶等[6]研究鰱魚肌肉蛋白質(zhì)的結(jié)果基本一致。

3 討論與結(jié)論

淡水魚在冷藏過程中鮮度下降、軟化并最終發(fā)生腐敗主要是因為酶催化導致的肌肉內(nèi)部組分的生理生化變化，而蛋白質(zhì)為肌肉組織的主要組成部分，其降解、聚合和變性都會導致蛋白質(zhì)功能的喪失，從而直接決定魚肌肉質(zhì)量的好壞。本實驗對冷藏過程中草魚肌肉中總蛋白質(zhì)、不同溶解性蛋白組分和不同結(jié)構(gòu)蛋白組分的變化情況進行了分析，結(jié)果表明：冷藏過程中草魚肌肉蛋白質(zhì)在逐漸發(fā)生降解，至第6～8天后肌球蛋白重鏈等大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)降解加速，幾乎完全消失(圖4)。冷藏過程中，肌原纖維蛋白在內(nèi)源酶的作用下逐漸降解，第 4～6天開始含量顯著降低(圖2)，導致魚體組織軟化，水溶性蛋白含量增加(圖1)，這又為微生物的生長提供了營養(yǎng)，從而不斷增殖和活動并引入大量外源酶作用，造成其他蛋白質(zhì)的進一步降解，最終導致魚肉品質(zhì)劣化和腐敗。

蛋白質(zhì)降解是魚肉腐敗的重要表現(xiàn)[20]，分析淡水魚肌肉蛋白質(zhì)的變化是深入研究其腐敗機理的重要手段，對針對性提出淡水魚肉保鮮研究具有重要指導意義。目前，國內(nèi)外對與腐敗有關的具體蛋白質(zhì)的降解細節(jié)和變化規(guī)律研究不多，了解甚少。本實驗探討了草魚冷藏過程中肌肉蛋白質(zhì)的組成特性變化，為研究淡水魚低溫貯藏過程中的肌肉蛋白質(zhì)降解規(guī)律提供了部分生物學證據(jù)。然而，需要指出的是，本實驗是以草魚背部肌肉小塊為研究對象，因此，其冷藏過程中蛋白質(zhì)的降解情況可能與完整草魚的降解情況存在差異；另外，不同魚體或不同部位的個體差異在今后的研究中也值得考慮。

草魚肌肉冷藏過程中不同溶解性蛋白質(zhì)變化趨勢有所不同，冷藏第4天為變化的重要時間點，水溶性蛋白含量開始顯著增加，酸、堿溶性蛋白含量開始減少，鹽溶性蛋白含量則先小幅增加至第8天開始下降；冷藏過程中3種不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的含量也均有所下降，其中肌原纖維蛋白自第4天開始顯著降低，而肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白則相對穩(wěn)定，含量減低幅度較小。此外，冷藏過程中肌肉總蛋白質(zhì)也在不斷降解，至第6～8天降解加速，肌球蛋白重鏈等大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)完全消失。

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