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    大豆?jié)饪s蛋白與還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的理化及抗氧化活性的研究*

    2013-02-09 03:04:36韓建春
    大豆科技 2013年2期
    關(guān)鍵詞:木糖拉德氨基

    李 鑫,劉 騫,韓建春,李 菁

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,哈爾濱 150030)

    大豆?jié)饪s蛋白(簡(jiǎn)稱(chēng)SPC)是用高質(zhì)量的低溫變性豆粕為主要生產(chǎn)原料,通過(guò)醇法或酸法除去醇溶性和/或水溶性后所制得的含有65%~90%(干基)蛋白質(zhì)(N×6.25)的粉狀大豆蛋白產(chǎn)品。目前,國(guó)內(nèi)生產(chǎn)廠家一般采用醇法生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白,其主要原因是醇法大豆?jié)饪s蛋白豆腥味較低,而且生產(chǎn)時(shí)不產(chǎn)生廢水,使得醇法大豆?jié)饪s蛋白成為市場(chǎng)上主要的大豆?jié)饪s蛋白。但醇法大豆?jié)饪s蛋白在加工過(guò)程中,由于乙醇的作用,使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,這樣很大程度上制約著大豆?jié)饪s蛋白的應(yīng)用。因此,加強(qiáng)和改善大豆?jié)饪s蛋白的理化特性以及其他生物活性,擴(kuò)大其在食品及其他領(lǐng)域的應(yīng)用,成為國(guó)內(nèi)外科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。

    將碳水化合物以共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)分子上的α或ε-氨基或羧基相結(jié)合形成糖基化蛋白的化學(xué)反應(yīng)稱(chēng)之為蛋白質(zhì)的美拉德修飾作用[1],主要包括縮合、降解、裂解、聚合等一系列反應(yīng)。糖基化反應(yīng)是自然條件下發(fā)生的非酶褐變,是食品加工和保存過(guò)程中涉及廣泛的蛋白質(zhì)與多糖和小分子等碳水化合物發(fā)生的反應(yīng)。另外,美拉德反應(yīng)的速率主要受到反應(yīng)物的組成、時(shí)間、溫度、反應(yīng)物濃度、pH等多種因素影響[2-6]。美拉德修飾可在一定程度上克服蛋白質(zhì)遇熱不穩(wěn)定問(wèn)題,與化學(xué)和酶法對(duì)蛋白質(zhì)改性相比,不需化學(xué)試劑,安全性高,可極大改善蛋白質(zhì)的乳化性、溶解性、熱穩(wěn)定性及抗氧化性等功能特性。管軍軍等人利用微波輻射的方法,合成了大豆分離蛋白—乳糖復(fù)合物,從功能性的研究表明,大豆分離蛋白—乳糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物溶解性與熱穩(wěn)定性較大豆分離蛋白有顯著的提高,而且抗氧化性也隨之增加[7]。姜瞻梅等人研究乳清蛋白與7種不同的還原糖通過(guò)干熱美拉德反應(yīng),測(cè)定其反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)特性,表明乳清蛋白糖基復(fù)合物的游離氨基酸含量均顯著降低,同時(shí)抗氧化活性明顯增強(qiáng)[8]。

    目前國(guó)內(nèi)外對(duì)大豆蛋白美拉德反應(yīng)的研究,主要集中在對(duì)大豆蛋白的功能特性等方面的改善作用[9-10],而對(duì)大豆蛋白—還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物特性以及其抗氧化活性的研究在我國(guó)未見(jiàn)太多報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定3種還原糖(葡萄糖、果糖與木糖)和大豆?jié)饪s蛋白反應(yīng)不同時(shí)間產(chǎn)生美拉德產(chǎn)物的理化性質(zhì)和抗氧化活性(主要包括pH值、色差值、游離氨基含量、還原能力和自由基清除能力),系統(tǒng)分析還原糖種類(lèi)和反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆?jié)饪s蛋白—還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物理化特性和抗氧化活性的影響,可為大豆?jié)饪s蛋白糖基復(fù)合物作為天然色素和天然抗氧化劑的應(yīng)用提供基本的技術(shù)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大豆?jié)饪s蛋白(65%蛋白含量):黑龍江雙河松嫩大豆生物工程有限責(zé)任公司;葡萄糖、果糖、木糖、鐵氰化鉀:上海國(guó)藥集團(tuán);TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)、ABTS(2,2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽):Sigma公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    KDN-F自動(dòng)定氮儀:上海纖檢儀器有限公司;JD500-2型電子天平:沈陽(yáng)龍騰電子稱(chēng)量?jī)x器有限公司;pHS-25型pH計(jì):上海精科雷磁儀器廠;DK-8B型電熱恒溫水浴鍋:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TGL-16C型高速離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;AL-104型精密電子天平:上海梅特勒—托利多儀器設(shè)備有限公司;WSC-S測(cè)色色差計(jì):上海光學(xué)物理研究所。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)的制備 稱(chēng)取一定量的大豆?jié)饪s蛋白分別與還原糖均勻混合,SPC與還原糖的質(zhì)量比為11003d11,磁力攪拌至固體全部溶解,后用蒸餾水定容至100mL,使溶液中SPC和還原糖的濃度都為0.3mol/L。取上述溶液10mL轉(zhuǎn)移到25mL的具塞試管中,蓋緊。在95℃水浴中加熱0.5~6.0h,并每隔一段時(shí)間取樣,然后立即放入冰水中冷卻。獲得的MRPs在4℃下保存,用于分析其理化特性和抗氧化活性。

    1.3.2 測(cè)定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的pH 用pH計(jì)測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間MRPs的pH。

    1.3.3 顏色的測(cè)定 用色差儀測(cè)定,先按照間歇測(cè)試方式進(jìn)行色差儀的調(diào)試,然后取一定量的MRPs,將其放入比色皿中,并將測(cè)試探頭放在比色皿上進(jìn)行測(cè)定。使用O/D測(cè)試頭,可測(cè)定物體本身的顏色和光澤及各檢測(cè)樣之間的色度差值。白板的校正值為L(zhǎng)*=90.26,a*=-1.29,b*=5.18。

    1.3.4 游離氨基含量的測(cè)定 參照Benjakul的方法[11],取125μL 8倍稀釋的MRPs樣品與2.0mL、0.2125mol/L、pH為8.2的磷酸鹽緩沖液混合,再加入濃度為0.01%的TNBS溶液1.0mL,用漩渦振蕩器混合均勻,并在50℃水浴中避光保溫30min,然后加入2.0mL濃度為0.1mol/L的亞硫酸鈉終止反應(yīng)。反應(yīng)后的樣品在室溫下冷卻15min,在420nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以L-亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物,按同樣方法繪制出亮氨酸濃度與吸光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,根據(jù)測(cè)定樣品的吸光值,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算得出樣品中的游離氨基含量。

    1.3.5 還原能力的測(cè)定 采用Yen等人的方法[12],做適當(dāng)修改。取0.5mL 8倍稀釋的樣品,加入2.5mL濃度為0.2mol/L、pH為6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5mL濃度為1.0%的鐵氰化鉀溶液,充分混合。將混合物在50℃水浴下保溫20min,再加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液,然后將混合物在3000r下離心10min。取2.5mL上層清液,加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液,混合均勻,在700nm處測(cè)定其吸光值。

    1.3.6 ABTS自由基清除活性的測(cè)定 參照Re等人的方法[13],并稍作修改。用pH 4.5的醋酸鈉緩沖溶液配制7mmol/L的ABTS儲(chǔ)備液,ABTS儲(chǔ)備液和最終濃度為2.45mmol/L的過(guò)二硫酸鉀反應(yīng)產(chǎn)生ABTS自由基,混合物預(yù)先在室溫黑暗處放置12~16h。穩(wěn)定后的ABTS自由基溶液,用pH 4.5的醋酸鈉緩沖溶液(20mmol/L)稀釋?zhuān)蛊湓?34nm處吸光度為0.7±0.02。然后取3mL該溶液與100μL MRPs樣品(8倍稀釋?zhuān)┏浞只旌?,避光放?min,在734nm處測(cè)定吸光度值。按照下面的公式計(jì)算ABTS自由基清除率:

    式中:Ac為反應(yīng)前ABTS自由基溶液的吸光值,As為反應(yīng)后樣品溶液的吸光值。

    1.3.7 羥基自由基清除 參照Lee等人的方法[14],取0.75mM鄰二氮菲1mL,而后依次加入PBS液2mL和蒸餾水1mL,充分混合,再加入0.75mM硫酸亞鐵溶液1mL并混合均勻。然后加入0.01%過(guò)氧化氫1mL,在37℃下保溫60min,于536nm處測(cè)其吸光值,其值為AP。然后用1mL蒸餾水代替1mL過(guò)氧化氫,測(cè)得值即為AB。最后用8倍稀釋的MRPs樣品1mL代替之前試驗(yàn)中的1mL蒸餾水,測(cè)得值為AS。

    清除率(%)=(AS-AP)/(AB-AP)×100%

    1.4 統(tǒng)計(jì)方法

    每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1(分析軟件,St Paul,MN)軟件包中Linear Models程序進(jìn)行,差異顯著性(P<0.05)分析使用Tukey HSD程序,采用Sigmaplot 9.0軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pH的變化

    結(jié)果見(jiàn)圖1。

    圖1 不同加熱時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物pH的變化

    由圖1可以看出,大豆?jié)饪s蛋白與3種還原糖美拉德反應(yīng)體系的pH隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,各反應(yīng)體系的pH均顯著下降(P<0.05),從初始的7.31~7.36,下降至6.86~7.08。還原糖種類(lèi)的不同對(duì)反應(yīng)體系的pH有顯著影響,另外,大豆?jié)饪s蛋白—木糖反應(yīng)體系的pH下降最顯著(P<0.05)。pH的下降,不僅是因?yàn)樵诜磻?yīng)過(guò)程中羰氨縮合封閉了游離氨基,而且也與反應(yīng)過(guò)程中甲酸、乙酸等酸性物質(zhì)的生成有關(guān)[15]。Brands等研究發(fā)現(xiàn),酪蛋白—葡萄糖體系中形成的有機(jī)酸含量比不添加酪蛋白的體系多,因此可以推斷,體系中有機(jī)酸的生成依賴(lài)于羰基基團(tuán)和氨基基團(tuán)中的碳氧雙鍵[16]。Li等人向大米蛋白中添加不同還原糖,研究美拉德反應(yīng)體系中pH的變化,結(jié)果表明大米蛋白和葡萄糖形成的MRPs樣品的pH要高于其他還原糖的MRPs樣品[17]。另外,在美拉德反應(yīng)的中間階段,由于一些具有緩沖能力的酸性化合物的產(chǎn)生,包括甲酸、醋酸、丙酮醛、乙二醛等,抑制了美拉德反應(yīng)體系的酸性,所以當(dāng)加熱時(shí)間延長(zhǎng)時(shí),pH的降低趨于平穩(wěn)狀態(tài)。

    2.2 顏色的變化

    由圖2可以看出,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,大豆?jié)饪s蛋白與3種還原糖美拉德反應(yīng)體系的a*值顯著增加(P<0.05)。同時(shí),相對(duì)于葡萄糖和果糖體系來(lái)說(shuō),大豆?jié)饪s蛋白—木糖反應(yīng)體系的a*值增加最顯著(P<0.05)。Morales等人研究發(fā)現(xiàn),MRPs中的大部分顏色主要產(chǎn)生在反應(yīng)的后期[5]。同時(shí),不斷增加的a*值也說(shuō)明,在3種體系中的類(lèi)黑精的產(chǎn)生是顏色變化的主要原因[18]。由于類(lèi)黑精是以短肽和色素結(jié)合而成的混合體,反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng),越有利于產(chǎn)生色素物質(zhì),從而加深反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度。

    圖2 不同加熱時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物顏色的變化

    2.3 游離氨基含量的變化

    在加熱過(guò)程中,MRPs游離氨基含量的變化如圖3所示。

    圖3 不同加熱時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物游離氨基含量的變化

    隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),大豆?jié)饪s蛋白與各還原糖反應(yīng)體系中的游離氨基含量都呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)(P<0.05),尤其在0~2h的加熱時(shí)間內(nèi),各體系中游離氨基含量明顯持續(xù)下降(P<0.05)。在美拉德反應(yīng)過(guò)程中,其游離氨基含量的變化一定程度上反映美拉德反應(yīng)的進(jìn)程,所消耗的游離氨基越多,反應(yīng)越徹底。這個(gè)結(jié)果表明,當(dāng)加熱進(jìn)行時(shí),蛋白質(zhì)或氨基酸的α-或ε-NH2基團(tuán)更大程度的與糖共價(jià)結(jié)合形成糖基化蛋白,同時(shí),MRPs重新排列成一個(gè)更穩(wěn)定的酮胺或阿馬杜里產(chǎn)物[19]。

    2.4 還原能力的變化

    還原能力的測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

    圖4 不同加熱時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還原能力的變化

    從700nm處吸光度的變化曲線可以看出,隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),各體系中MRPs的還原能力顯著增加(P<0.05),大豆?jié)饪s蛋白—木糖體系的MRPs的還原能力要顯著高于其他兩種還原糖反應(yīng)體系(P<0.05)。Yoshimura等人研究表明,蛋白質(zhì)—還原糖MRPs的還原能力與顏色變化程度有良好的線性關(guān)系,反應(yīng)體系褐變程度越深,還原能力越高[20]。Morales等人通過(guò)研究指出,在葡萄糖—賴(lài)氨酸MRPs中存在許多能消除過(guò)氧化物的化合物(主要存在于褐色素中),過(guò)氧化物間接引發(fā)脂類(lèi)氧化[5]。另外,MRPs顯著抗氧化能力很可能與它們強(qiáng)有力消除過(guò)氧化物有關(guān)。

    2.5 ABTS和羥基自由基清除活性的變化

    如圖5(a)所示,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),各體系中MRPs的ABTS自由基清除活性顯著增加(P<0.05),與還原能力相同,木糖反應(yīng)體系產(chǎn)生的MRPs的ABTS自由基清除活性要顯著高于其他兩種還原糖反應(yīng)體系(P<0.05)。以反應(yīng)時(shí)間6h為例,木糖體系產(chǎn)生的MRPs對(duì)ABTS自由基清除活性可達(dá)52.90%,而葡萄糖和果糖產(chǎn)生的MRPs的ABTS自由基清除活性分別為40.14%和44.43%。尹姿等人研究發(fā)現(xiàn),木糖—甘氨酸產(chǎn)生的MRPs對(duì)ABTS自由基的清除能力隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)[21];同時(shí),隨著反應(yīng)產(chǎn)物濃度的增大,其清除率逐漸增大,濃度為3.2mg/mL時(shí),自由基清除率達(dá)到了98.5%左右。

    圖5 不同加熱時(shí)間產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物ABTS自由基(a)與羥基自由基(b)清除活性的變化

    如圖5(b)所示,與ABTS自由基清除活性相似,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),各反應(yīng)體系的羥基自由基清除率均顯著增強(qiáng)(P<0.05),木糖體系MRPs的羥基自由基清除率提高最為顯著(P<0.05)。MRPs在發(fā)揮抗氧化作用時(shí),有可能是作為氫供體,其本身也是金屬螯合劑,可以螯合Fe2+,因此MRPs擁有比較強(qiáng)的羥基自由基清除能力,也有可能與具有螯合Fe2+的能力有關(guān)[22]。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)通過(guò)3種還原糖分別與大豆?jié)饪s蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng),研究其產(chǎn)物的理化特性及抗氧化活性。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證實(shí)該反應(yīng)是一個(gè)酸度和顏色逐漸增強(qiáng)的反應(yīng)。在反應(yīng)過(guò)程中均有一定的新物質(zhì)產(chǎn)生,反應(yīng)過(guò)程中所生成的MRPs具有良好的抗氧化功能,其中木乳糖反應(yīng)體系得到的MRPs具有最高程度的褐變和最顯著的還原能力以及自由基清除能力。因此,大豆?jié)饪s蛋白—還原糖反應(yīng)體系產(chǎn)生的MRPs可以作為一種抗氧化劑來(lái)防止食物的脂質(zhì)氧化。

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