量子點(diǎn)為載體轉(zhuǎn)染survivinsiRNA至人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞的研究

孫 晰 趙建江 邱小玲

南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·廣東省口腔醫(yī)院外科，廣東廣州 510280

人類腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展大多是由于基因的改變致細(xì)胞凋亡的異常引起的。 人體常見的口腔腫瘤細(xì)胞中，survivin 基因的水平一般都會(huì)升高，它會(huì)抑制細(xì)胞凋亡。 細(xì)胞凋亡與增殖一樣，是一個(gè)高度可調(diào)節(jié)性的生物化學(xué)過程。 RNA 干擾 （RNA interference，RNAi）成為目前的熱點(diǎn)研究之一，它是多種生物體內(nèi)由雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子介導(dǎo)的基因阻抑現(xiàn)象，通過導(dǎo)入外源或內(nèi)源的dsRNA，細(xì)胞內(nèi)加工后產(chǎn)生siRNA（小分子干擾RNA 片段）可以特異性阻滯基因的表達(dá)，使內(nèi)源性mRNA 發(fā)生特異性降解，從而引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。

量子點(diǎn)（quantum dot，QD）是一種直徑在 1~100nm 的半導(dǎo)體納米顆粒， 而粒徑在2~10nm 的量子點(diǎn)可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。 QD 具有特殊的光學(xué)特性， 單一種類的QD 能按照尺寸變化產(chǎn)生發(fā)光波長(zhǎng)不同、顏色分明的熒光，并且這種熒光的強(qiáng)度和穩(wěn)定性都大大優(yōu)于有機(jī)熒光染料， 可以讓研究人員更長(zhǎng)時(shí)間地觀察細(xì)胞或組織；此外，QD 具有良好的生物相容性，對(duì)細(xì)胞的毒性低。 2010 年1 月—2012 年9 月在該研究中，利用量子點(diǎn)作為非病毒的基因轉(zhuǎn)染載體， 對(duì)口腔鱗癌Tca8113 細(xì)胞中高表達(dá)的凋亡抑制基因Survivin 的siRNA 進(jìn)行修飾并轉(zhuǎn)染至人舌鱗癌Tca8113 細(xì)胞中, 達(dá)到有效抑制survivin 基因的表達(dá)至腫瘤細(xì)胞凋亡的目的。 以期望對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)的凋亡抑制基因Survivin 基因沉默提供理論和實(shí)踐依據(jù)，探索出一種安全，低毒，高效并可進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)的siRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)載體。

1 材料

1.1 轉(zhuǎn)染所需設(shè)備試劑

（1）人舌鱗癌 Tca8113 細(xì)胞

（3）量子點(diǎn)（QD605）：表面帶正電荷的水溶性量子點(diǎn)，4 mol/L

（4） LIPOFECTAMINE 2000 脂質(zhì)體

（5） OPTI-MEM I 培養(yǎng)基

（6） 熒光顯微鏡：OLYMPUS，IX51

1.2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 所需主要試劑及設(shè)備

1.2.1 主要試劑 ①Trizol RNA 提取試劑；②氯仿；③異丙醇；④無水乙醇；⑤SYBR Green PCR Master Mix；⑥焦碳酸二乙酯（DEPC）；⑦TBE 電泳緩沖液：Tris 堿 54 g，硼酸 27.5 g，0.5 mol/EDTA(PH：8.0)20 mL，加雙蒸水600 mL，劇烈攪拌至溶解，加水至1000 mL定溶，即為5×TBE，用時(shí)加雙蒸水稀釋成0.5×TBE；⑧核酸染料。

1.2.2 主要設(shè)備 ①高速冷離心機(jī)：Heraeus，Megafuge 1.0 R；②定量 PCR 儀：ABI PRISM 7500*Sequence Detection System； ③電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：Heraeus，UT6； ④Eppendof 管、Tip 頭等均用 0.1%的DEPC 水浸泡過夜，用無菌蒸餾水沖洗后，高壓滅活DEPC 活性，37℃烤箱烘干備用；⑤電熱恒溫水浴鍋：Grant，OLS200；⑥凝膠成像分析系統(tǒng)：Tanon1600；⑦電泳儀：Tanon，DYY-6X 型；⑧純水制備系統(tǒng)：Millipore；⑨醫(yī)用微波爐：Galanz。

電化學(xué)直接氧化法是通過反應(yīng)過程中的污染物直接與電極電子傳遞，通過陽極的高電勢(shì)進(jìn)行氧化降解廢水中的有機(jī)污染物和無機(jī)污染物。在氧化過程中,污染物不同導(dǎo)致被氧化的程度也不相同[19]。國(guó)外一些研究學(xué)者用電化學(xué)方法處理高鹽廢水,用石墨作為實(shí)驗(yàn)電極材料，研討了電氧化方法的相關(guān)參數(shù)(鹽濃度、電流密度、時(shí)間、pH等)對(duì)去除有機(jī)物的作用及影響等[20]，把處理過后的廢水應(yīng)用于制革工藝，事實(shí)表明電化學(xué)氧化工藝可以用于處理高鹽廢水。

2 方法

2.1 Tca8113 細(xì)胞的培養(yǎng)

細(xì)胞傳代培養(yǎng)到3~4 代時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 量子點(diǎn)介導(dǎo)survivin siRNA 轉(zhuǎn)染Tca8113 細(xì)胞

（1）當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞貼壁，達(dá)到80%~90%融合后，于轉(zhuǎn)染前1 d，以4×105細(xì)胞/孔接種于6 孔板，于含血清、不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞融合率達(dá)到60%~70%。 細(xì)胞隨機(jī)分為三組：實(shí)驗(yàn)組（量子點(diǎn)組）、對(duì)照組（LIPOFECTAMINE 2000 脂質(zhì)體），空白組（未轉(zhuǎn)染組）。

（2）溶液 1 的配制：實(shí)驗(yàn)組：237.5 L OPTI-MEM I+12.5 L QD 每孔（總體積 250 L），室溫孵育 5 min；對(duì)照組：245L OPTI-MEM I+5 L lipofectamine 2000 每孔（總體積 250 L），室溫孵育 5 min；

（3）溶液 2 的配制：245 L OPTI-MEM I+5 L siRNA 每孔（總體積 250 L）。

（4）將溶液 1 輕輕地與溶液 2 混合，室溫下孵育 20 min。 同時(shí)，將6 孔板的細(xì)胞用無血清且不含抗生素的培養(yǎng)基漂洗2 遍，加入 1.5 mL OPTI-MEM I。

（5）將溶液1 與溶液2 的混合液逐滴加入孔中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。 置37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~6 h 后更換含血清不含抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，置37℃,5% CO2養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

（6） 轉(zhuǎn)染24 h 后在熒光顯微鏡藍(lán)光下觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況并拍照，同時(shí)計(jì)算轉(zhuǎn)染率。 轉(zhuǎn)染率=（每100 個(gè)細(xì)胞中表達(dá)熒光的細(xì)胞/100）×100%

2.3 定量 RT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 48h 的 Tca8113 細(xì)胞中 survivin mRNA 表達(dá)

（1）細(xì)胞總 RNA 的提取

（2）去基因組

使用 RNase-free 的 DNase（Promega），按以下體系配置反應(yīng)液，37 ℃消化 30 min，65 ℃滅活 10 min。

（3）總 RNA 純度和完整性檢測(cè)

①純度檢測(cè)：取 1 μL RNA 樣品60 倍稀釋，在BioPhotometer plus 艾本德核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定OD 值，OD260/OD280 的比值＞1.8，說明制備的RNA 較純，無蛋白質(zhì)污染。

②總 RNA 完整性檢測(cè)： 取 RNA 樣品 1 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳80V×20 min， 用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA 的5s rRNA，18 s rRNA 和28 s rRNA 條帶，三條條帶完整的話即可證明總RNA 抽提比較完整。

（4）逆轉(zhuǎn)錄

（5）定量 PCR

①檢測(cè)序列片段大?。粌?nèi)參片段: 18SrRNA-112 bp，目的片段: survivin -180 bp (GeneID: 332)。

②設(shè) 計(jì)的引物 ：qh- survivin-F1: 5’ AAATGACTTGGCTCGATGCT；qh- survivin-R1：5’ TCCATCATCTTACGCCAGACT。

③反應(yīng)體系：

表1 反應(yīng)體系

（4）反應(yīng)條件： 95℃ 5min,

融解曲線分析：溫度 60~95 ℃

每個(gè)樣重復(fù)3 次。

3 結(jié)果

3.1 量子點(diǎn)組與 lipofectamine 組轉(zhuǎn)染 survivin siRNA 至 Tca8113細(xì)胞的情況

熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光表達(dá)， 說明標(biāo)記有FAM 綠色熒光的siRNA 有效轉(zhuǎn)染入Tca8113 細(xì)胞中， 組間轉(zhuǎn)染率差異不明顯（圖1、2）。

圖1 熒光顯微鏡下實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況（×100）

3.2 實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 Tca8113 細(xì)胞中 survivin mRNA 的表達(dá)情況

各組轉(zhuǎn)染后48 h 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞survivin mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。 表2 可見： 轉(zhuǎn)染 48 h 后 Tca8113 細(xì)胞中實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組survivin mRNA 的相對(duì)表達(dá)量只有空白組的0.36 倍、0.1 倍，表達(dá)水平均有下降。 見圖3。

表2 實(shí)時(shí)定量RF-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Tca8113 細(xì)胞中survivin mRNA的表達(dá)情況

圖2 熒光顯微鏡下實(shí)對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況（×100）

圖3 轉(zhuǎn)染48 h 后survivin 的相對(duì)表達(dá)量

4 討論

激光共聚焦顯微鏡證實(shí)了量子點(diǎn)為載體可以成功轉(zhuǎn)染survivin siRNA 至Tca8113 細(xì)胞（圖2）以及量子點(diǎn)的使用范圍在安全范圍內(nèi)， 接下來本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Tca8113 細(xì)胞內(nèi)survivin mRNA 表達(dá)量下降的百分比，本實(shí)驗(yàn)設(shè)立lipofectamine2000 脂質(zhì)體這一經(jīng)典轉(zhuǎn)染載體作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組用 50 pmolQD 轉(zhuǎn)染 100 pmol survivin siRNA 入 Tca8113 細(xì)胞48h 后，檢測(cè)到survivin siRNA mRNA 表達(dá)量相對(duì)于空白組下降 64%，QD 與 siRNA 的使用比例為 1∶2（圖1）；對(duì)照組中用 100 pmol lipofectamine2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 100 pmol survivin siRNA 入Tca8113 細(xì)胞 48h 后， 檢測(cè)到 survivin siRNA mRNA 表達(dá)量相對(duì)于空白組下降 90%，QD 與 siRNA 的使用比例為1∶1（常規(guī)比例）。因此，本實(shí)驗(yàn)QD 的用量為經(jīng)典轉(zhuǎn)染載體lipofectamine2000 脂質(zhì)體參考使用量的一半， 對(duì)靶細(xì)胞Survivin 基因的沉默率超過lipofectamine2000 脂質(zhì)體的一半，這些結(jié)果表明，量子點(diǎn)在可觀察性和沉默率方面都表現(xiàn)了良好的特性。

survivin 基因是凋亡抑制蛋白基因家族的一個(gè)新成員, 鑒于該蛋白在腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖中的重要作用,自發(fā)現(xiàn)以來已經(jīng)成為人類基因組中眾多腫瘤特異基因的代表之一,其蛋白因其特殊生物學(xué)功能被認(rèn)為是針對(duì)腫瘤治療的一個(gè)強(qiáng)有力的靶分子。survivin 的主要生物學(xué)功能就是抗凋亡, 它是目前已知作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白。

RNA 干擾（RNA interference,RNAi） ，如今已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最熱門的研究課題之一。 RNA 干擾是指在生物體內(nèi)，通過外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA 引發(fā)的序列特異性基因沉默，在此過程中長(zhǎng)雙鏈RNA 被Dicer 識(shí)別加工后， 成為只具有21~25 nt長(zhǎng)度的短雙鏈RNA 即 SiRNA, SiRNA 是RNAi 過程中的效應(yīng)分子，與某些核蛋白酶形成一個(gè)復(fù)合體（RISG），RISG 再通過SiRNA 的反義鏈識(shí)別具同源序列的 mRNA 并使其降解，從而導(dǎo)致特定基因基因沉默[1]，由于RNAi 具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此RNAi 可以作為一種強(qiáng)有力的研究工具， 用于功能基因組和基因治療的研究。 2002 年 12 月 20 日, Si RNA & RNAi 被 Science 雜志評(píng)為年度十大科技成就之首，Nature 雜志亦將Si RNA 評(píng)為年度重大科技成果之一。

盡管RNAi 技術(shù)飛速發(fā)展，但在機(jī)制研究和應(yīng)用方面還存在著許多問題。 在應(yīng)用研究領(lǐng)域，最主要的問題還是轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的選擇。目前轉(zhuǎn)運(yùn)SiRNA 至細(xì)胞內(nèi)主要通過病毒或非病毒載體，對(duì)于病毒載體，如慢病毒，腺伴隨病毒等，雖然高效，但是安全性和毒性限制了它的發(fā)展[2-3]；對(duì)于非病毒載體，他們的低效率是限制他們使用的主要因素[4]。 有學(xué)者研究[5]，有機(jī)熒光修飾 SiRNA 后轉(zhuǎn)運(yùn)，通過熒光顯微鏡進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，但是，5~10 s 熒光信號(hào)就喪失了一半多。最重要的是，長(zhǎng)時(shí)間同時(shí)追蹤和監(jiān)測(cè)多種SiRNA 的轉(zhuǎn)運(yùn)，觀察基因沉默是一件非常困難的事。 因此，發(fā)現(xiàn)一種安全，低毒，高效和自我追蹤和監(jiān)測(cè)多種SiRNA 的轉(zhuǎn)運(yùn)載體非常迫切。

近年來，隨著納米技術(shù)，生物技術(shù)與材料技術(shù)的飛速發(fā)展，量子點(diǎn)(QD)作為生物分子的熒光檢測(cè)，特別是為多種分子同時(shí)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)提供了可能。 量子點(diǎn)表現(xiàn)出獨(dú)特的光學(xué)特征，目前研究證實(shí)：量子點(diǎn)的發(fā)光特性具有以下特點(diǎn)[6-11]：①量子點(diǎn)的激發(fā)光波的范圍寬且連續(xù)分布，而發(fā)射波長(zhǎng)的范圍窄且對(duì)稱分布，斯托克斯（Stokes）位移大，不同量子點(diǎn)或同一材料不同粒徑的量子點(diǎn)在同一光源下發(fā)射出不同的顏色的光，即發(fā)射光譜不出現(xiàn)交疊，或只有很少交疊， 這使得不同粒徑量子點(diǎn)標(biāo)記的各類分子容易區(qū)分，識(shí)別。 量子點(diǎn)的發(fā)光特征具有嚴(yán)格的量子點(diǎn)尺寸效應(yīng)，通過改變量子點(diǎn)粒徑大?。◤?.8~7 nn）可獲得從紫外到近紅外范圍或從藍(lán)色到紅色波長(zhǎng)范圍內(nèi)任意點(diǎn)的光譜， 這些光學(xué)特征十分適合修飾多種SiRNA 后轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)觀察基因沉默的情況。 ②量子點(diǎn)熒光產(chǎn)率高，發(fā)光強(qiáng)度強(qiáng)，光化學(xué)穩(wěn)定性好，不易被光解或漂白，它的發(fā)光強(qiáng)度是目前用的有機(jī)熒光強(qiáng)20 倍，光化學(xué)穩(wěn)定性則提高了100 倍以上。 這可對(duì)SiRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)后基因沉默長(zhǎng)時(shí)間觀察。 綜上所述，量子點(diǎn)因其特殊的光學(xué)特性不僅可對(duì)siRNA 轉(zhuǎn)染過程進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察， 并且能夠有效的抑制Tca8113 細(xì)胞survivin mRNA 的表達(dá)，因此量子點(diǎn)有望作為RNA 干擾技術(shù)的新型載體。

[1]HunotS,FLavellRA.Apoptosis:Death of a nonopoly[J].Science,2001,292(5518): 865-866.

[2]Hannon GJ,Rossi JJ.Unlocking the potential of the human genome with RNA Interference[J].Nature，2004,43(7006):371-378.

[3]Clay M.The silent treatment[J].Nature，2004,431(7008):599.

[4]Thomas M,Lu JJ,Ge Q,Zhang CC,et al.Full deacylation of polyethylenimine dramatically boosts its gene delivery efficiency and specificity to mouse lung[J].Proc Nat Acad Sci USA，2005,102(16):5679-5684.

[5]Dahan M,Levi S,Luccardini C.et al.Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single quantum dot tracking [J].Science, 2003,302:442-445.

[6]Chan WCW,Maxwell DJ,Gao XH.et al.Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging [J].Curr Opin Biotechnol，2002,13(1):40-46.

[7]Alivisatos P.The use of nanocrystals in biological detection [J].Nat Biotechnol, 2004,22(1):47-52.

[8]Tanke HJ,Dirks RW,Raap T.Fish and immumocytochemistry: Towards visualizing single target molecules in living cells [J].Curr Opin Biotechnol, 2005,16(1):49-54.

[9]Michalet X,Pinaud FF,Bentolila LA,et al.Quantum dots for live cells,in vivo imaging and diagnostics[J].Science, 2005,307(5709):538-544.

[10]Alam F,Yadav N.Potential applications of quantum dots in mapping sentinel lymph node and detection of micrometastases in breast carcinoma[J].J Breast Cancer,2013,16(1):1-11.

[11]Brakmane G,Madani SY,Seifalian A.Cancer Antibody Enhanced Real Time Imaging Cell Probes-A Novel Theranostic Tool using Polymer Linked Carbon Nanotubes and Quantum Dots [J].Anticancer Aqents Med Chem,2013, 2013 Mar 27.