青海湖裸鯉三磷酸甘油醛脫氫酶基因的克隆和表達(dá)特性

衛(wèi)福磊，李長忠，史建全，祁得林，梁健，謝保勝，趙蘭英，祁洪芳

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧 810016;2.青海湖裸鯉救護(hù)中心，西寧 810016;3.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)俗稱湟魚，屬鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，裂腹魚亞科(Schizothoracinae)，裸鯉屬，是青海湖中唯一的水生經(jīng)濟(jì)動物，處于青海湖整個生態(tài)系統(tǒng)的核心地位。青海湖地處海拔三千多米的高原上，水溫低，餌料生物貧乏，故此魚生長緩慢，生長300～500 g 平均需要7～10 年時間。它是國家二級保護(hù)魚類，1998 年被《中國瀕危動物紅皮書》列為瀕危物種［1］。青海湖裸鯉屬于洄游產(chǎn)卵型魚類，每年從青海湖洄游至淡水河流中產(chǎn)卵繁殖，環(huán)境的改變促使洄游的青海湖裸鯉也發(fā)生一系列適應(yīng)性的變化［2，3］。在過去的50 年里，由于青海湖鹽度的增加［4］、人工過度捕撈以及生長緩慢等原因，野生青海湖裸鯉存儲量從1960 年的20 ×104噸［5］減少到了現(xiàn)在不足0.5 ×104噸［6］。實踐證明，青海湖裸鯉的人工增殖、放流是一種保護(hù)和恢復(fù)青海湖裸鯉資源的有效方法。積極開展青海湖裸鯉基礎(chǔ)生物學(xué)特征和對低氧、低溫、鹽堿環(huán)境適應(yīng)的分子機(jī)理的研究，有助于揭示青海湖裸鯉的基本生命活動規(guī)律，為該魚種的資源保護(hù)和人工、增殖放流提供理論依據(jù)。

3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)是糖酵解途徑中的一個關(guān)鍵酶，是一種多功能性蛋白。在大部分物種中由于GAPDH 具有高度種屬保守序列，在很多組織中都高水平表達(dá)，且表達(dá)量一般相對恒定，故常被用作RT－PCR、Western blot 等實驗操作的內(nèi)源參照基因［7］。但是，近年來的研究也發(fā)現(xiàn)GAPDH 的表達(dá)水平并不穩(wěn)定，在不同動物中利用它作為內(nèi)標(biāo)來進(jìn)行半定量分析受到質(zhì)疑［8－10］。因此，進(jìn)行青海湖裸鯉生理適應(yīng)的分子機(jī)理的研究，有必要了解GAPDH作為內(nèi)標(biāo)的可靠性。

GAPDH 參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，例如DNA修復(fù)［11］、tRNA 出核過程［12］、膜融合與運(yùn)輸作用［13，14］以及細(xì)胞凋亡等。根據(jù)Hara 的研究，GAPDH 參與的細(xì)胞凋亡涉及NO－巰基亞硝基化－GAPDH－Siah 途徑，即經(jīng)巰基亞硝基化的GAPDH 可以特異的與E3－泛素連接酶Siah 形成復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)入細(xì)胞核后的Siah 使細(xì)胞核蛋白質(zhì)降解，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡作用［15，16］。另一方面，蛋白激酶B 可以對GAPDH 蛋白237 位蘇氨酸磷酸化而抑制其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，阻止GAPDH 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用［17］。此外還發(fā)現(xiàn)GAPDH 能夠特異地與肌醇1，4，5－三磷酸受體結(jié)合，并且在代謝過程中產(chǎn)生的NADH 能夠進(jìn)一步調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放［18］，通過鈣離子信號通路對于細(xì)胞增殖、分化、凋亡進(jìn)行調(diào)控。盡管對于GAPDH 結(jié)構(gòu)和分子催化基本特征方面取得了一定進(jìn)展，但是對于其功能調(diào)節(jié)的機(jī)制卻知之甚少。掌握青海湖裸鯉GAPDH 分子的序列和結(jié)構(gòu)特征，有助于全面了解GAPDH 在青海湖裸鯉環(huán)境適應(yīng)方面的作用機(jī)制。

本研究利用RT－PCR 和RACE 方法得到了青海湖裸鯉3－磷酸甘油醛脫氫酶旁系同源體基因(Gp-GAPDHα、Gp-GAPDHβ)cDNA 全長序列，通過序列特征分析及其在不同組織和受精卵不同發(fā)育階段表達(dá)水平研究，初步掌握了GAPDH 作為內(nèi)標(biāo)的可靠性，并為GAPDH 在青海湖裸鯉適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

青海湖裸鯉取自青海湖裸鯉救護(hù)中心原種培育基地養(yǎng)殖場(青海，西寧)，均為淡水池塘養(yǎng)殖的2+齡雌魚，體重300～500 g，體長27～35 cm。試驗用魚運(yùn)回實驗室后暫養(yǎng)于裝滿淡水養(yǎng)殖箱中。隨機(jī)選取健康的青海湖裸鯉3 條以上個體用于實驗，取青海湖裸鯉不同組織于液氮中保存。青海湖裸鯉胚胎發(fā)育不同階段取自青海湖裸鯉救護(hù)中心剛察孵化站，青海湖裸鯉卵細(xì)胞人工受精后于淡水中孵化，孵化用水引自沙柳河(青海，西寧)，為地表徑流水，水溫保持在13～17℃，溶氧量＞5.0 mg/L。

主要試劑:Ex Taq 酶、pMD19－T 載體、RNA 提取試劑RNAiso Plus reagent、PrimeScript RTase Kit、5‘Full RACE Kit 和3′Full RACE Core Set Ver.2.0 購自寶生物工程有限公司(大連)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA marker 購自生工生物工程有限公司(上海)。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA 的提取和GAPDH 基因快速擴(kuò)增(RACE)cDNAs 末端模板制備

取于液氮中保存的鰓組織液氮研磨，加入RNAiso Plus reagent 中提取RNA。對于提取的總RNA 樣品進(jìn)行定量并電泳檢測后，依照PrimeScript RTase Kit、5′ Full RACE Kit 和3′ Full RACE Core Set Ver.2.0 分別制備RT－PCR 和RACE 擴(kuò)增模板。

1.2.2 Gp-GAPDH 基因特異性片段的擴(kuò)增

根據(jù)斑馬魚、大西洋鮭魚等已知的GAPDH 基因保守cDNA 序列設(shè)計引物GAPDHF1 和GAPDHR1(表1)，以青海湖裸鯉第一鏈cDNA 為模板，擴(kuò)增得到Gp-GAPDHα 基因特異性片段。使用GAPDHF1 和GAPDHR1 為RACE 引物進(jìn)行Gp-GAPDH基因末端擴(kuò)增，卻同時得到兩種堿基存在明顯差異的基因序列，分別命名為 Gp-GAPDHα 和 Gp-GAPDHβ。

1.2.3 Gp-GAPDHα 基因全長擴(kuò)增

依照5′ Full RACE Kit 說明，使用引物Gp－GAPDHαR1(表1)與5′ RACE inner primer(Takara，Kyoto，Japan)為擴(kuò)增引物，5′ RACE 產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到5′端非編碼區(qū)。同時，以3′ RACE產(chǎn)物為模板，使用引物Gp－GAPDHαF1(表1)與3′RACE inner primer(Takara，Kyoto，Japan)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到Gp-GAPDHα 基因3′端非編碼區(qū)。對上述獲得的序列進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接序列在基因序列3′端非編碼區(qū)與 5′ 端非編碼區(qū)設(shè)計引物 GPGAPDHαF2 和GP－GAPDHαR2(表1)進(jìn)行驗證PCR反應(yīng)。

1.2.4 Gp-GAPDH β 基因全長擴(kuò)增

設(shè)計用于Gp-GAPDH β 基因5′ RACE 擴(kuò)增的特異引物Gp－GAPDHβR1(表1)與3′ RACE 擴(kuò)增的特異引物Gp－GAPDHβF1(表1)分別與5′ RACE Inner Primer 和3′ RACE inner Primer 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到5′端非編碼區(qū)及3′端非編碼區(qū)。對上述獲得的序列進(jìn)行拼接得到Gp-GAPDHβ 基因全長序列，根據(jù)拼接序列在基因序列3′端非編碼區(qū)與5′端非編碼區(qū)設(shè)計引物GP－GAPDHβF2 和GP－GAPDHβR2(表1)進(jìn)行驗證PCR 反應(yīng)。

表1 PCR 所使用的引物名稱與引物序列Tab.1 Primer names and sequences used in the PCR

1.2.5 Gp-GAPDH 基因序列分析

利用在線工具ExPaSy(http://www.expasy.ch/tools/dna.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列基本性質(zhì)預(yù)測。使用在線工具Intropro 進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測。不同物種的GAPDH 氨基酸序列下載于GenBank 數(shù)據(jù)庫，通過分析軟件Vector NTI(Infor－Max，F(xiàn)rederick，USA)進(jìn)行同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ 法)的構(gòu)建。

1.2.6 Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 基因在青海湖裸鯉不同組織中的表達(dá)水平檢測

提取青海湖裸鯉心臟、腦、鰓、肌肉、腎臟和卵巢6 種組織總RNA。由于Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ編碼區(qū)相似度較高，為避免引物非特異性結(jié)合，根據(jù)各自3′端非編碼區(qū)設(shè)計Gp-GAPDHα 基因半定量RT－PCR 特 異 引 物: semi－GAPDHαF1、 semi－GAPDHαR1、semi－GAPDHβF1 和 semi－GAPDHβR1(表1)。以青海湖裸鯉β-actin 為參照，先后進(jìn)行3次RT－PCR 實驗。Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 基因PCR 擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃ 3 min;94℃ 45 s，56℃30 s，72℃25 s，30 循環(huán);72℃10 min。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳和生物圖形軟件Gel－Pro analyzer 分別檢測其在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平差異。

1.2.7 Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 基因在青海湖裸鯉受精卵不同發(fā)育階段的表達(dá)水平檢測

青海湖裸鯉產(chǎn)沉粘性卵，人工脫粘之后，調(diào)控水溫和水流量于溶氧大于5.0 mg/L 流動淡水中孵化，全部仔魚出膜約7 d 左右。于液氮中保存未發(fā)育成熟Ⅳ期卵母細(xì)胞、發(fā)育至多細(xì)胞期、囊胚期、原腸中期、原腸晚期、神經(jīng)胚期和器官形成期胚胎，提取各發(fā)育階段總 RNA，使用 RT－PCR 分別檢測 Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 在受精卵不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平的變化，方法同1.2.3。

1.2.8 統(tǒng)計分析與繪圖

根據(jù)Gel－Pro analyzer 對表達(dá)條帶密度進(jìn)行掃描，表達(dá)量以均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤(mean ± SE)表示，同時使用Minitab(Minitab，USA)統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析(P＜0.05)。通過Origin 7(OriginLab，USA)繪制柱形圖。

2 結(jié)果

2.1 Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 的克隆與序列分析

使用引物GAPDHF1(表1)和GAPDHR1(表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到特異性條帶，經(jīng)測序為Gp-GAPDHα 片段，使用此對引物分別進(jìn)行5′與3′端RACE 反應(yīng)，卻得到了序列存在明顯差異的Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 基因3′與5′末端序列。根據(jù)已得到末端序列分別設(shè)計相應(yīng)5′與3′端RACE引物，進(jìn)行末端擴(kuò)增、序列拼接和驗證PCR，得到Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 基因全長序列。

2.1.1 Gp-GAPDHα 基因克隆

利用引物 Gp－GAPDHαR1 與 5′－RACE inner primer 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到Gp-GAPDHα 基因526 bp 的5′端序列。利用引物Gp－GAPDHαF1 與3′RACE inner primer 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到長度為854 bp 的3′端序列，序列拼接得到Gp-GAPDHα 基因全長序列共1302 bp。使用 GP－GAPDHαF2 和 GPGAPDHαR2 進(jìn)行驗證性PCR 擴(kuò)增獲得包含Gp-GAPDHα 編碼區(qū)全長的基因序列共1070 bp(圖1)，GenBank 注冊號為:JX287372。

2.1.2 Gp-GAPDHβ 基因克隆

使用引物 Gp－GAPDHβR1 與5′ RACE Inner Primer 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到5′端序列458 bp，引物Gp－GAPDHβF1 與3′ RACE inner Primer 進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到3′端序列1203 bp。序列拼接得到Gp-GAPDHβ 基因全長序列共1403 bp，根據(jù)拼接序列在基因序列3′端非編碼區(qū)與5′端非編碼區(qū)設(shè)計引物GP－GAPDHβF2 和GP－GAPDHβR2 進(jìn)行驗證PCR 反應(yīng)，獲得包括Gp-GAPDHβ 編碼區(qū)全長基因序列共1167 bp(圖2)。GenBank 注冊號為:JX287373。

圖1 Gp-GAPDHα 基因的克隆Note:M.Marker;1.PCR product of 5′RACE;2.PCR product of 3′RACE;3.PCR product of confirming PCR.Fig.1 Gene clones of Gp-GAPDHα.

圖2 Gp-GAPDHβ 基因的克隆Note:M.Marker;1.PCR product of 5′RACE;2.PCR product of 3′RACE;3.PCR product of confirming PCRFig.2 Gene clones of Gp-GAPDHβ

2.2 序列分析

如圖3A，Gp-GAPDHα 基因全長序列由70 bp 的5′端非編碼區(qū)、1002 bp編碼區(qū)和230 bp 的3′端非編碼區(qū)序列構(gòu)成。Gp-GAPDHα 基因開放性讀碼框包含1002 bp核苷酸序列，編碼333 個氨基酸，該蛋白分子量為35.7 ×103，等電點為8.73，不含信號肽序列。Gp－GAPDHα 蛋白序列與硬骨魚GAPDH 蛋白序列同源性分別為:斑馬魚95%(Dr－GAPDH1)和74%(Dr－GAPDH2);石鯛魚91%(Rb－GAPDH1)和73%(Rb－GAPDH2)。與人類GAPDH 蛋白序列同源性為84%(Hs－GAPDH1)和74%(Hs－GAPDH2)(表2)。

如圖3B，Gp-GAPDHβ 基因全長序列由67 bp 的5′端非編碼區(qū)、1008 bp編碼區(qū)和328 bp 的3′端非編碼區(qū)序列構(gòu)成。Gp-GAPDHβ 基因開放性讀碼框包含100 bp 核苷酸序列，其編碼335 個氨基酸，該蛋白分子量為36.0 kDa，等電點為6.58，不含信號肽序列。Gp－GAPDHβ 蛋白序列與硬骨魚GAPDH 蛋白序列同源性分別為:斑馬魚73%(Dr－GAPDH1)和97%(Dr－GAPDH2);石鯛魚73%(Rb－GAPDH1)和92%(Rb－GAPDH2)。與人類GAPDH 蛋白序列同源性為73%(Hs－GAPDH1)和66%(Hs－GAPDH2)(表2)。

圖3 (A)青海湖裸鯉GAPDH 旁系同源體編碼基因Gp-GAPDHα 及氨基酸序列Note:Gp－GAPDH has a putative NAD + binding domain(shaded)，a conserved catalytic domain(underlined)and GAPDH active site(bold and italic).Fig.3 (A)cDNA sequences and deduced amino acid sequences of G.przewalskii glyceraldehyde 3－phosphate dehydrogenase paralogue isoforms:Gp-GAPDHα.

圖3 (B)青海湖裸鯉GAPDH 旁系同源體編碼基因Gp-GAPDHβ 及氨基酸序列Note:Gp－GAPDH has a putative NAD + binding domain(shaded)，a conserved catalytic domain(underlined)and GAPDH active site(bold and italic).Fig.3 (B)cDNA sequences and deduced amino acid sequences of G.przewalskii glyceraldehyde 3－phosphate dehydrogenase paralogue isoforms:Gp-GAPDHβ.

表2 不同物種GAPDH 氨基酸序列比對及NJ 法構(gòu)建進(jìn)化樹Tab.2 Phylogenetic reconstruction using Neighbor－joining(NJ)method with G.przewalskii glyceraldehyde 3－phosphate dehydrogenase isoform α(Gp－GAPDHα)and isoform β(Gp－GAPDHβ)with those of other species

注:GenBank 登錄號:GpGAPDHα，GAPDH［青海湖裸鯉］(JX287372);GpGAPDHβ，GAPDH［青海湖裸鯉］(JX287373);DrGAPDH1，GAPDH［斑馬魚］(NP_001108586.1);DrGAPDH2，GAPDH［斑馬魚睪丸型］(NP_998259.1);RbGAPDH1，GAPDH［石鯛1］(ACF35052.1);RbGAPDH2，GAPDH［石鯛2］(ACF35053.1);HsGAPDH1，GAPDH［人類1］(NP_002037.2);HsGAPDH2，GAPDH［人類2］(NP_001243728.1)。Note:GenBank accession numbers are as follows:GpGAPDHα，GAPDH［Gymnocypris przewalskii］(JX287372);GpGAPDHβ，GAPDH［Gymnocypris przewalskii］(JX287373);DrGAPDH1，GAPDH［Danio rerio］(NP_001108586.1);DrGAPDH2，GAPDH［Danio rerio］(NP_998259.1);Rb－GAPDH1，GAPDH［Oplegnathus fasciatu］(ACF35052.1);RbGAPDH2，GAPDH［Oplegnathus fasciatus］(ACF35053.1);HsGAPDH1，GAPDH［Homo sapiens1］(NP_002037.2);HsGAPDH2，GAPDH［Homo sapiens］(NP_001243728.1).

2.3 Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 表達(dá)模式的研究

2.3.1 Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 在青海湖裸鯉不同組織中表達(dá)量分析

圖4 不同組織中Gp-GAPDH 表達(dá)模式Note:1.Heart;2.Brain;3.Gill;4.Muscle;5.Kidney;6.OvaryFig.4 Expression pattern of Gp-GAPDH in different tissues

以β-actin 基因的表達(dá)作參比，轉(zhuǎn)錄水平用三次Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 分別對參比基因密度的比值所得的(±s)表示。如圖4，圖的上部為三次電泳結(jié)果之一，不同組織中Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ的表達(dá)量方差分析結(jié)果表明，Gp-GAPDHα 在心臟和腦組織中表達(dá)量最高且表達(dá)量相似，鰓、肌肉、腎臟中表達(dá)量相似但相對較低，在卵巢中表達(dá)量適中(P＜0.05)。Gp-GAPDHβ 在鰓組織中的表達(dá)量最多，在心臟、肌肉、腎臟和卵巢組織中表達(dá)量差異不大，在腦組織中表達(dá)量最少(P＜0.05)。

2.3.2 青海湖裸鯉胚胎發(fā)育不同階段Gp-GAPDHα與Gp-GAPDHβ 表達(dá)量的分析

以青海湖裸鯉β-actin 為參照，對Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 在青海湖裸鯉胚胎發(fā)育不同階段的表達(dá)量變化進(jìn)行分析。如圖5，方差分析結(jié)果表明，Gp-GAPDHα 在4 期卵母細(xì)胞、多細(xì)胞期、原腸中期、原腸晚期、神經(jīng)胚期和器官形成期表達(dá)水平差異不顯著，但在囊胚期表達(dá)量最高(P＜0.05)。Gp-GAPDHβ在青海湖裸鯉胚胎不同發(fā)育階段表達(dá)量的差異較大，即在未成熟的卵細(xì)胞和器官形成期表達(dá)量最高，從卵細(xì)胞受精至神經(jīng)胚期之間表達(dá)量很小(P＜0.05)。

3 討論

本研究報道了青海湖裸鯉3－磷酸甘油醛脫氫酶兩種旁系同源體基因Gp-GAPDHα 和Gp-GAPDHβ 的全長cDNA 序列，兩者的氨基酸序列與其他物種存在廣泛的同源性。通過對兩種基因在不同組織和受胚胎不同發(fā)育階段中轉(zhuǎn)錄水平的研究，初步分析其作為參照基因的可靠性。

圖5 胚胎發(fā)育不同階段Gp-GAPDH 表達(dá)模式Note:1.Oocytes of phase 4;2.Multicellular stage;3.Blastula stage;4.Middle gastrula stage;5.Late gastrula stage;6.Neurula stage;7.Period of organogenesis.Fig.5 Expression pattern of Gp-GAPDH at different stages of embryogenesis

人體存在兩種相似的GAPDH 基因，分別為Hs－GAPDH1 和Hs－GAPDH2，其中Hs－GAPDH1 廣泛分布與不同組織中，而Hs－GAPDH2 為睪丸組織特異性表達(dá)。在石鯛魚中同樣發(fā)現(xiàn)GAPDH 存在兩種旁系同源體，Rb－GAPDH1 和Rb－GAPDH2，分別編碼333和335 個氨基酸序列，普遍分布于不同組織中，兩者的相似性為74%［19］。本次實驗克隆得到的Gp－GAPDHα 和 Gp－GAPDHβ 與 Rb－GAPDH1 和 Rb－GAPDH2 相似度分別為91%和92%，這說明硬骨魚中兩種GAPDH 旁系同源體是普遍存在的，而與哺乳動物存在一定差異。進(jìn)一步對Gp－GAPDHα 和Gp－GAPDHβ 與斑馬魚三磷酸甘油醛脫氫酶序列Dr－GAPDH1 和Dr－GAPDH2 進(jìn)行相似性比較，發(fā)現(xiàn)Gp－GAPDHβ 與斑馬魚睪丸型Dr－GAPDH2 更加相似(97%)。已有的研究表明，GAPDH 旁系同源體在脊索動物早期進(jìn)化中通過基因復(fù)制而出現(xiàn)，GAPDH2在大部分物種進(jìn)化中丟失，僅存在于蜥蜴類、哺乳動物和魚類，在魚類不同組織都有分布［20］。

通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析表明，Gp－GAPDHα、Gp－GAPDHβ 蛋白具有GAPDH 蛋白基本結(jié)構(gòu)域:NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域和保守的催化結(jié)構(gòu)，同時還包括一個保守的GAPDH 活性位點(圖3)。所得到的兩種Gp-GAPDH 旁系同源體基因存在明顯差異，雖然兩種推測編碼蛋白都具有3－磷酸甘油醛脫氫酶特征性催化結(jié)構(gòu)域和NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)，但是同源性卻只為74%，等電點差異更大，分別為:Ip(Gp－GAPDHα):8.73，Ip(Gp－GAPDHβ):6.58。在青海湖裸鯉同時存在這兩種Gp－GAPDH 旁系同源體，它們的功能及其差異需要進(jìn)一步研究。

β-actin 經(jīng)常作為參照基因?qū)δ康幕虮磉_(dá)量進(jìn)行校正，根據(jù)對于硬骨魚的研究中發(fā)現(xiàn)，β-actin 更適合作為參照基因使用，在牙鲆不同發(fā)育階段的內(nèi)參基因選擇過程中發(fā)現(xiàn)，GAPDH 的表達(dá)差異相當(dāng)顯著，而β-actin 基因相對較穩(wěn)定［10］。通過黃花魚的研究發(fā)現(xiàn)，β-actin 是在免疫反應(yīng)中表達(dá)量比較穩(wěn)定的基因，可以作為對照基因［21］。通過RT－PCR 檢測半滑舌鰨在內(nèi)毒素物質(zhì)刺激條件下β-actin 在不同組織中表達(dá)量，并未發(fā)現(xiàn)明顯差別，認(rèn)為其可作為可靠的參照基因使用［22］。因此，本研究以β-actin 為參照基因?qū)τ贕p-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Gp-GAPDHα 與Gp-GAPDHβ 在青海湖裸鯉不同組織和受精卵發(fā)育不同階段表達(dá)量存在較大差異，尤其Gp-GAPDHβ 在胚胎發(fā)育不同階段差異顯著。初步斷定Gp-GAPDHβ 不適合作為參照基因，而Gp-GAPDHα 表達(dá)穩(wěn)定性需要進(jìn)一步研究，選擇其作為參照基因需謹(jǐn)慎。

魚類胚胎發(fā)育通常需經(jīng)歷卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚器和器官形成期后進(jìn)入孵化階段，當(dāng)魚類受精卵細(xì)胞發(fā)育至器官形成期，細(xì)胞進(jìn)入分化與凋亡活動更加活躍的階段。在以小鼠為模式動物的研究中，Schlisser 發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎器官形成期，GAPDH 介導(dǎo)致畸劑Teratogen 產(chǎn)生的氧化脅迫從而導(dǎo)致小鼠畸形［23］，我們推測GAPDH 在魚類受精卵的正常發(fā)育過程中起著重要的作用，兩種異形體的功能需要做進(jìn)一步研究。

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