植物中鈣解碼機制的研究進展＊

顧志敏，張海良，陳析豐，馬伯軍

(浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004)

Ca2+作為重要的第二信使，在植物應答光照、極端溫度、機械損傷、干旱、鹽、植物激素和病原菌激發(fā)子等生物和非生物脅迫反應中具有重要的作用［1］.在真核生物中，由Ca2+轉運體對細胞質中的鈣離子濃度(［Ca2+］)進行嚴格的調控.正常情況下，細胞質中［Ca2+］保持在低濃度水平(100～200 nmol/L).而在細胞受到某種刺激后，細胞質中［Ca2+］會發(fā)生特異性的變化，即產(chǎn)生Ca2+簽名(Ca2+signature)［2］.特異性的“Ca2+簽名”是借助于細胞內質膜和細胞器膜上的離子通道和轉運蛋白產(chǎn)生的［1，3-5］.盡管大量的生理研究表明植物細胞中存在大量的Ca2+轉運蛋白［3，6］，但是專門傳送Ca2+內流的通道蛋白的分子特性至今仍不清楚.最近研究發(fā)現(xiàn):類環(huán)核苷酸門控通道(CNGCs)等非特異性陽離子通道能夠提高病原菌防御性信號轉導途徑中的Ca2+導率［7］;而在花粉管的生長中，類谷氨酸受體蛋白(GLRs)能夠介導非特異性的Ca2+內流［8］.這些研究表明，非特異性陽離子通道在Ca2+簽名的形成中可能具有重要的作用.

盡管多種環(huán)境刺激均可引起細胞質中［Ca2+］增加，產(chǎn)生Ca2+簽名，但在不同的刺激下，細胞內［Ca2+］變化的部位和時間特征不同，因此所產(chǎn)生的Ca2+簽名也具有特異性.不同的下游反應因子(受Ca2+調控的蛋白質)對Ca2+簽名作出反應，稱為解碼(decoding).環(huán)境脅迫不但可誘發(fā)植物細胞產(chǎn)生鈣信號，而且還可誘導Ca2+傳感器蛋白的表達.Ca2+傳感器蛋白的激活是Ca2+簽名產(chǎn)生后信號繼續(xù)傳遞的下游事件，Ca2+傳感器參與解碼特異性的Ca2+簽名，并直接導致特異性生理反應的產(chǎn)生［6］.大部分Ca2+傳感器蛋白擁有典型的螺旋-環(huán)-螺旋的EF 手型基序，并且成對存在，這些EF 手型基序導致傳感器蛋白通過Ca2+依賴型的構象改變而結合Ca2+.研究最多的模式植物擬南芥，其基因組編碼了至少250 個EF 手型蛋白［9］.植物中三大類型EF 手型蛋白是:鈣調素(CaMs)及類鈣調素蛋白(CMLs)、鈣依賴型蛋白激酶(CDPKs)和類鈣調磷酸酶B 亞基蛋白(CBLs).從概念上來講，植物Ca2+傳感器蛋白作為信號元件可被分成“傳感器依賴型”和“傳感器響應型”兩大類［10］.例如:CDPKs 通過Ca2+傳感功能(EF 手型基序)和Ca2+應答功能(蛋白激酶活性)與一個單一蛋白結合，從而被歸類為傳感器響應型蛋白.因此，這些激酶能將Ca2+簽名編碼的信息翻譯成特定靶蛋白中的磷酸化事件.相反，沒有酶催化功能的CaM/CML 家族成員是通過Ca2+依賴型蛋白-蛋白互作改變下游靶蛋白活性的，因此，它們代表著典型的傳感器依賴型蛋白.由于缺少一些酶活性，CBL 蛋白也屬于傳感器依賴型蛋白.但是，CBLs 能特異性地與一種稱作CBL-結合蛋白激酶(CIPKs)的激酶家族互作.因此，CBL-CIPK 復合體被看作是雙分子傳感響應器［11］.下文中筆者將會討論每個Ca2+傳感器蛋白家族的機制和生物學功能.

1 植物中的Ca2+傳感器蛋白

1.1 CDPKs 的Ca2+感知和應答

目前研究發(fā)現(xiàn)，鈣依賴型蛋白激酶(CDPK)僅存在于植物和一些雙鞭毛原生生物中［12-14］.擬南芥基因組中有34 個CDPKs.CDPK 由1 個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶域、1 個自我抑制結構域和1 個類CaM 結構域組成，含有4 個EF 手型基序［15］.在正常Ca2+水平下，激酶域的激活部位是通過與自我抑制結構域互作而被抑制的.一旦胞內Ca2+濃度上升，Ca2+結合到類CaM 結構域，使自我抑制結構域被取代，導致激酶激活［16］.CDPKs的這種激活過程大大提高了這些蛋白的自磷酸化，進而促進所有激酶的激活.根據(jù)預測，大多數(shù)CDPKs 的N 末端被豆蔻?；?或S-?；揎?，雙脂質修飾可以提高這些蛋白的膜附著和膜定位.對蒺藜苜蓿中CPK3［17］和水稻中CPK2［18］的詳細研究，揭示了它們的膜定位分別嚴格取決于豆蔻酰化和S-?；饔?此外，也證明了其余的CDPKs 定位于包括質膜、內質網(wǎng)膜(ER)和過氧化物膜在內的不同細胞膜上［19-20］.與這些定位研究一致的是各種各樣的膜蛋白可以作為CDPKs 的特定底物.在擬南芥中，慢(S-型)陰離子外流通道SLAC1 定位于質膜上，SLAC1 被激酶CPK21 和CPK23 所調節(jié)，在植物激素脫落酸(ABA)的應答中調控氣孔的關閉.一旦SLAC1與激酶CPK21 和CPK23 共表達，陰離子電流可以顯示出2 個蛋白激酶對SLAC1 的刺激.然而，SLAC1 的Ca2+敏感型激活僅僅指向CPK21.因為在體內的磷酸化實驗分析中，CPK23 似乎更傾向于對Ca2+不敏感［21-22］.此外，馬鈴薯中CDPK4 和CDPK5 的磷酸化和質膜上的NADPH 氧化酶RBOHB 的激活導致了活性氧(ROS)的增多［23］.相對而言，Ca2+泵ACA2 定位于內質網(wǎng)膜上是由于擬南芥中的CPK1 通過N 末端的磷酸化而負調控的［24］.明顯可以看出，ACA2 是通過與CaMs 的互作被正調控的［25］，表明ACA2 可能是2 種不同的Ca2+信號轉導途徑的集合點.

最近的研究發(fā)現(xiàn)，CDPKs 調節(jié)底物的功能似乎不單單局限于膜蛋白.擬南芥中的CPK4，CPK11 和CPK32 磷酸化并正調控脫落酸響應型bZIP 轉錄因子(ABFs)［26-27］.在煙草中，轉錄激活子RSG 與由NtCDPK1 調節(jié)的赤霉素(GA)信號通路有關.RSG 中Ser-114 的磷酸化使其與14-3-3蛋白互作并且間接導致了RSG 從細胞核進入細胞溶質中［28］.因此，CDPK 介導的磷酸化作用在調節(jié)不同的細胞隔間的不同生物過程中起著重要的作用.

1.2 CBL-CIPK 網(wǎng)絡系統(tǒng)下的Ca2+感知和應答

CBL-CIPK 信號系統(tǒng)是近年來新發(fā)現(xiàn)的鈣離子信號識別和傳導系統(tǒng).CBL 蛋白(Calcineurin Blike proteins，簡稱CBLs)是一類與動物鈣調磷酸酶B 亞基(CNB)及中樞神經(jīng)鈣感受器(NCS)極其相似的小分子蛋白，每個CBL 蛋白含有4 個變異程度不等的EF 手型基序［11］.CIPK 蛋白(CBLinteracton protein kinases，簡稱CIPKs)是CBL 特定靶向的一類絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶［8］.CIPKs 在N 端含有一個與酵母SNF1(sucrose nonfermenting)、動物AMPK(AMP-activated protein kinase)極其相似的激酶催化域(該結構域高度保守)，在C 端含有一個高度變異的調控域，所有CIPK 的C 端調控域均含有一個高度保守的由21 個氨基酸組成的FISL 模體(也稱為NAF 模體)，F(xiàn)ISL 模體主要用于結合CBL［29］.CBLs 能夠感知逆境激發(fā)的特異性Ca2+信號，結合Ca2+后與CIPKs 特異性作用，形成CBL-CIPK 復合體，通過翻譯后磷酸化下游靶蛋白或調節(jié)轉錄因子及脅迫應答基因，實現(xiàn)不同細胞水平、組織部位抗逆性的調控.

在CBL-CIPK 信號系統(tǒng)中，CBL 蛋白感知Ca2+簽名并且與CIPK 激酶中保守的NAF 結構域互作［30］.CBL 結合NAF 結構域釋放激酶域的C末端的自我抑制結構域，從而將激酶轉變成激活的構象［31］，因此CBL 蛋白的特性決定了CBLCIPK 的亞細胞定位，從而在靶蛋白的識別中產(chǎn)生空間特異性.然而，CBL-CIPK 復合體的底物特異性是由CIPK 決定的.另外，最近的研究發(fā)現(xiàn)，CIPKs 與CBLs 互作后，能夠以某種機制磷酸化CBLs，這個磷酸化過程對于CBL-CIPK 復合體作用于下游靶蛋白是必須的［32-33］.

CBL-CIPK 復合體的特異性和可選擇性，使得擬南芥中一個特定的CBL 可以與26 個CIPKs 中的多個成員互作;反之，一個特定的CIPK 也可以與10 個CBLs 中的幾個成員互作.這表明其中可能存在著一個對空間特異性和特異性生理靶蛋白調控的指導原則［34］.例如，酵母雙雜交和BiFC 實驗分析表明CBL1 與CIPK1 和其他5 個CIPKs 互作，而CIPK1 與8 個CBL 互作［31，35-36］.進一步研究發(fā)現(xiàn):擬南芥CBL1-CIPK1 復合體在干旱和滲透壓脅迫應答中發(fā)揮作用，而在鹽脅迫中沒有作用［37-38］;而CBL4-CIPK24 和CBL1-CIPK24 復合體在鹽脅迫中起作用［39-40］.

對擬南芥中全部10 個CBLs 的定位分析表明，CBLs 中可變的N 末端對特異性亞細胞定位非常重要［31］.其中，4 個CBL 蛋白定位于質膜上，另外4 個定位于液泡膜上，2 個定位于細胞質和細胞核中［31］.這些不同的亞細胞定位，表明CBL在內部和外部Ca2+儲存源的局部Ca2+釋放中行使快速繼電器的功能，有助于Ca2+信號的空間特異性分布.有意思的是，與CBL 蛋白不同，大多數(shù)CIPKs 定位于胞質和核質中［31，39］.然而，體內的CBL-CIPK 互作分析表明CBL-CIPK 復合體中的CIPKs 的亞細胞定位由CBL 的特性決定［31，37，39］.例如:CIPK1 通過CBL1 或CBL9 定位于質膜上［37-38］;而一旦與CBL2 互作，CBL2-CIPK1 復合體則專一性地定位于液泡膜上［35］.在植物的耐鹽信號傳導中，CIPK24 與CBL4 或CBL10 都能夠互作形成不同的復合體，其工作模型是:在根中，CBL4-CIPK24 復合體通過調節(jié)質膜上的H+/Na+逆向轉運體SOS1 來介導鈉離子的外流;而在地上部，CBL10-CIPK24 復合體通過調節(jié)未知的靶蛋白將鈉離子儲存于液泡內［13，41］.

近幾年鑒定的一些離子轉運蛋白中，很多都屬于CBL-CIPK 復合體的靶蛋白.例如，鉀離子通道蛋白AKT1 的活性是由CIPK23 在與CBL1 或CBL9 互作的情況下調控的［37，42-43］.有意思的是，在植物中，CBL1/9-CIPK23 復合體不僅調節(jié)了鉀離子的吸收，也調節(jié)了硝態(tài)氮的攝取.生物化學和反向遺傳學實驗結果表明，CIPK23 作為一個關鍵的調節(jié)器，通過磷酸化硝酸鹽轉運體CHL1 的Thr101 氨基酸殘基，介導低和高親和力的硝酸鹽運輸模式的轉換［44］.

最近，在對鉀離子通道蛋白AKT2 的調節(jié)作用的研究中，Held 等［45］發(fā)現(xiàn)擬南芥中Ca2+傳感器CBL4 與它的互作蛋白激酶CIPK6，通過介導鉀離子通道蛋白AKT2 轉移到質膜上，調節(jié)AKT2的活性和膜位置.重要的是，依賴于CBL4 的豆蔻酰化和棕櫚?；碾p脂質修飾作用，使CIPK6 中一個獨立的C 末端調節(jié)結構域介導CBL4 依賴型和Ca2+依賴型的通道從內質網(wǎng)膜遷移到質膜上［46］.因此，這一工作揭示了離子通道調節(jié)的一個重要機制:Ca2+傳感器通過輸送一個互作依賴型而非磷酸化依賴型的激酶轉移到質膜上，調節(jié)K+通道的活性.

1.3 CaMs/CMLs 的Ca2+感知和傳導

在真核生物中，鈣調素(CaMs)是保守的Ca2+傳感器蛋白.動植物中的CaM 有著高度相似的結構.在擬南芥中，7 種基因編碼了4 種CaM 亞型，而亞型的不同僅僅是由于其中1～5 個氨基酸殘基的不同所引起的.擬南芥的基因組編碼了50 個類鈣調蛋白(CMLs)亞型，它們被認為是從原始的CaMs 進化而來的，而現(xiàn)在的CaMs 卻表現(xiàn)出高度的結構差異，甚至在EF 手型基序的數(shù)量方面也差異很大［47］.CaMs 和CMLs 與Ca2+結合后，它們的構象會發(fā)生改變，從而使CaMs 和CMLs 蛋白與它們的靶蛋白發(fā)生互作［46，48］.迄今為止，包括激酶、磷酸酶、離子轉運體、代謝酶和轉錄因子在內的許多蛋白已經(jīng)被鑒定為CaMs/CMLs的靶蛋白［49］.

植物中，CaM 依賴型蛋白激酶(CaMKs)的活性由其與CaM 特異性結合來產(chǎn)生或增強.此外，一些植物中也存在Ca2+-CaM 依賴型蛋白激酶(CCaMKs)，除包含有CaM 結合結構域外，CCaMKs 還含有一個類視錐蛋白Ca2+結合結構域［47］.有意思的是，真核生物中，促分裂素原活化蛋白激酶(MAP 激酶)的偶聯(lián)和Ca2+/CaM 通路能夠交叉.例如，擬南芥的有絲分裂原激活蛋白激酶8(MPK8)需要CaM 的結合與MPK 激酶3(MKK3)的磷酸化作用同時進行，才能全面激活其活性［50］.另外，MPK 磷酸酶1(MKP1)通過與Ca2+依賴型CaM 結合被激活［51］.

CaMs/CMLs 在調節(jié)基因表達中也起著重要的作用.例如，有報道指出，擬南芥的CaMK(AtCBK3)和一個CaM 依賴型磷酸酶(AtPP7)分別通過磷酸化作用或去磷酸化作用正調控或負調控 熱 休 克 轉 錄 因 子［52-53］.CAMTAs，WRKYs 和MYBs 等轉錄因子都是通過與CaMs 直接互作而被調控的［54-56］.值得注意的是，CaMs/CMLs 雖被歸類為“傳感器依賴型”，但擬南芥的CaM7 似乎本身就有轉錄因子的功能，CaM7 能夠與啟動子互作并激活某些光誘導基因［57］.這個發(fā)現(xiàn)也提供了一種新的Ca2+信號通路對轉錄調節(jié)的作用模式:CaM7 能夠解碼細胞質的Ca2+簽名后，通過與DNA 結合來調節(jié)基因的表達.

2 展 望

Ca2+信號幾乎參與了植物生長發(fā)育的全過程，因為刺激產(chǎn)生特異性Ca2+簽名是Ca2+信號中重要而基本的一步.在過去的十年中，人們對植物中Ca2+解碼過程的研究取得了重大的進展.在信息處理的關鍵步驟中，植物具有一個廣泛而復雜的Ca2+結合蛋白工具包，其功能是作為Ca2+傳感器來解碼各種各樣的Ca2+簽名.CaMs，CMLs，CDPKs和CBL-CIPK 復合體形成錯綜復雜的信號網(wǎng)絡系統(tǒng)，能夠將Ca2+簽名轉化為磷酸化反應和轉錄調節(jié)等下游反應.正是有了這些重要的解碼過程，才使得信息處理過程變得靈活而強大.

現(xiàn)在，我們對于Ca2+傳感器蛋白或傳感器/激酶復合體的生化特性、生理功能和靶蛋白的認識都有了很大程度的提高，同時，對信號網(wǎng)絡系統(tǒng)中信息處理過程的功能性原理也有了認知.然而，目前對Ca2+傳感器蛋白精確地感知和傳導鈣簽名的機制仍然不清楚.因此，未來關于鈣信號研究的方向有3 個:1)確定不同的轉錄和調節(jié)機制，因為它們負責組裝這些不同的信號模塊和通路;2)闡明植物中幾個獨立的Ca2+信號系統(tǒng)形成的原因，以及它們是如何互相聯(lián)系的;3)闡明植株中Ca2+信號與其他第二信使和激素調節(jié)的互作機制.成功地解決這些問題將會極大地推進對植物有機體全面理解的進程.

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