豬苓和澤瀉對肺纖維化大鼠模型血清TGF-β1、TNF-α影響研究

劉本佼，胡海波，周兆山，姜 文

（1.山東中醫(yī)藥大學碩士研究生，山東 濟南250014；2.青島市海慈醫(yī)療集團肺病科，山東 青島266021；3.青島大學醫(yī)學院，山東 青島 266021）

豬苓和澤瀉對肺纖維化大鼠模型血清TGF-β1、TNF-α影響研究

劉本佼1，胡海波2，周兆山2，姜 文3

（1.山東中醫(yī)藥大學碩士研究生，山東 濟南250014；2.青島市海慈醫(yī)療集團肺病科，山東 青島266021；3.青島大學醫(yī)學院，山東 青島 266021）

目的：觀察豬苓和澤瀉對肺纖維化大鼠模型血清TGF-β1、TNF-α的影響。方法：將72只健康雄性W istar大鼠隨機分為6組，以支氣管內注射博萊霉素的方法制作肺纖維化動物模型。給藥后第14天、28天光鏡下觀察大鼠肺組織病理變化情況，ELISA法檢測各組血清中TGF-β1、TNF-α的濃度。結果：各組病理學指標提示大鼠肺組織出現(xiàn)明顯的肺間質纖維化，提示動物模型復制成功。通過肺纖維化模型大鼠的病理學改變及血清內TGF-β1、TNF-α濃度比較，各給藥組與模型對照組均有顯著性差異（P＜0.05）。醋酸潑尼松組的指標改善程度最為顯著，豬苓加澤瀉組次之，豬苓組及澤瀉組最弱。結論：豬苓、澤瀉及其合用可降低肺纖維化大鼠血清中TGF-β1、TNF-α濃度，減輕博萊霉素誘發(fā)的肺纖維化進程。

肺纖維化；豬苓；澤瀉；轉化生長因子-β1；腫瘤壞死因子-α

［Abstra a c c t t］Objective：To investigate Zhuling、Zexie and Their Combined Use on the concentrations of TGF-β1and TNF-α of pulmonary fibrosis rats and explore the mechanism of treating pulmonary fibrosis with Zhuling、Zexie and Their Combined Use.Methods：Seventy-two male Wistar rats were divided random ly into six groups，Then rats induced pulmonary fibrosis with bleomycin endotracheally.Half rats were sacrificed on the fourteen day and the left ones were sacrificed on the twenty-eighth day.The rat lung histopathology was examined with HE staining and the concentrations of TGF-β1and TNF-α in the blood serum were examined by Elisa.Results：Changes of pulmonary histopathology in each group were typical，pointed out that Pulmonary Fibrosis Rats Model were successful.The concentrations of TGF-β1and TNF-α in blood serum in each treatment group were significantly decreased than those in model control group（P ＜ 0.05）.Compared comprehensively，prednisone acetate group had the best improvement，then the combination of Zhuling and Zexie group，and Zhuling group and Zexie group worst.Conclusion：The concentrations of TGF-β1and TNF-α in the blood serum of pulmonary fibrosis rats could be significantly reduced by Zhuling、Zexie and Their Combined Use，which may alleviate the degree of bleomycin induced pulmonary fibrosis in rats.

肺間質纖維化是一組以肺間質彌漫性滲出、浸潤和纖維化為主要病變的疾病，近年來的研究認為是多種原因導致的肺泡上皮損傷、壞死，成纖維細胞或肌成纖維細胞在病灶部位增殖，引起纖維化的細胞因子增多，最終導致肺泡與肺間質一體化的纖維化［1］。傳統(tǒng)治療以激素和免疫抑制劑為主，長期使用會產(chǎn)生明顯不良反應。中醫(yī)治療肺纖維化，初有療效［2，3］。針對西醫(yī)治療肺纖維化尚無特效藥物及糖皮質激素等治療所產(chǎn)生的不良反應，導師在治療肺纖維化時用淡滲利濕藥物，以減輕和緩解咳嗽、氣短、憋氣等癥狀，取得良好成效?，F(xiàn)將導師臨床治療肺纖維化使用頻率最高的淡滲利濕藥物豬苓、澤瀉，借助肺纖維化動物模型進行肺纖維化大鼠模型血清TGF-β1、TNF-α的影響研究，報道如下。

1 材料與方法

動物與分組：清潔級健康雄性wistar大鼠72只（由青島派特福德白鼠養(yǎng)殖合作社提供），體質量180 ~ 220g，月齡2 ~ 3個月，在室溫18 ~ 22℃、空氣相對濕度為28%的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、醋酸潑尼松組、豬苓組、澤瀉組、豬苓加澤瀉組，共6組，每組12只。

藥物：注射用鹽酸博萊霉素由日本化藥株式會社生產(chǎn)，配置成溶液（0.5mg/100g加入0.3mL生理鹽水）。醋酸潑尼松由上海信誼藥廠生產(chǎn)，制成0.4mg/mL溶液。中藥水煎液由青島市海慈醫(yī)療集團中藥制劑室制備。

試劑及儀器：大鼠TGF-β1ELISA試劑盒、TNF-αELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)），Nikon YS100光學顯微鏡（日本Olympus公司生產(chǎn)）。

動物模型制備：將大鼠以腹腔注射10%水合氯醛（0.2mL/100g）方法麻醉后，模型對照組及治療組60只大鼠氣管內注入博來霉素溶液（0.5mg/100g加入0.3mL生理鹽水），并輕揉胸部片刻，使其均勻地分布于肺組織內。正常對照組大鼠注入同體積生理鹽水。造模后模型對照組大鼠出現(xiàn)體質量下降、進食減少、活動減少等癥狀和體征，光鏡下顯示肺泡組織結構破壞，肺纖維化明顯加重，說明大鼠模型制備成功［4］。

給藥方法和途徑：各組均從造模第2天開始灌胃給藥，醋酸潑尼松組給予醋酸潑尼松6mg（/kg·d），豬苓組、澤瀉組、豬苓加澤瀉組大鼠需生藥分別為22g /（kg·d）、33g /（kg·d）、33g /（kg·d）， 模型對照組及正常對照組給予同等量生理鹽水。

觀察指標與檢測方法：給藥后第14天、第28天分兩批處死大鼠，第1批每組隨機取6只大鼠，腹主動脈取血5mL，低溫下離心血，取上清液，-20℃保存，待測；摘取右下肺，用中性甲醛固定24h后石蠟包埋、切片，行HE染色。觀察所選取肺組織的病理變化情況。用雙抗體夾心ELISA法檢測大鼠血清中TGF-β1、TNF-α的含量，操作嚴格按ELISA試劑盒說明書的步驟進行。給藥第28天，操作與第14天步驟同。

統(tǒng)計學處理：采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，所得結果以均數(shù)±標準差（±s ）表示，配對資料采用t檢驗，樣本的組間比較采用方差分析，數(shù)據(jù)間關系采用相關分析。P＜0.05作為顯著性差異水平。

2 結 果

2.1肺組織病理改變

肉眼觀察：對照組大鼠雙肺呈粉紅色，表面光滑，富有彈性。模型組大鼠雙肺顏色暗紅，部分邊緣點狀出血，部分肺葉體積縮小，彈性偏差，藥物組處于兩者之間。光鏡下觀察對照組各時期肺組織未見明顯病變，模型對照組與治療組第14天肺泡腔內可見大量的炎性細胞滲出、成纖維細胞增殖、肺泡間隔增厚、肺泡腔縮小；第28天時肺泡間隔增厚、成纖維細胞增多、肺泡腔明顯縮小、膠原纖維形成。與文獻報道一致［5］，證明造模成功。治療組與模型對照組病理變化有著同一規(guī)律，但肺泡炎、肺纖維化程度都輕于模型對照組。

2.2給藥后大鼠血清TGF-β1和TNF-α含量

各組大鼠血清中TGF-β1和TNF-α的含量比較：①給藥后第14天、第28天的兩個時間段內各組大鼠血清中TGF-β1及TNF-α的含量總體均數(shù)不等或不全等（P＜0.05），說明各處理因素對大鼠的血清中TGF-β1及TNF-α的含量有影響；大鼠血清中TGF-β1及TNF-α的含量醋酸潑尼松組、各中藥組與模型對照組比較有顯著性差異（P＜0.05），醋酸潑尼松組與各中藥組比較有顯著性差異（P＜0.05），各中藥組比較之間無顯著差異。②給藥后第14天、第28天各組大鼠血清中TGF-β1及TNF-α的含量的前后比較有顯著性差異（P＜0.05）。見表1。

表1 第14天各組大鼠血清中TGF-β1和TNF-α含量比較 （±s）

表1 第14天各組大鼠血清中TGF-β1和TNF-α含量比較 （±s）

組別 n TGF-β1 TNF-α第14天 第28天 第14天 第28天正常組 6 10.56±0.64 10.63±0.59 78.71±2.29 67.22±1.76模型對照組 6 38.82±2.54 42.80±3.50 144.02±7.71 156.36±7.39醋酸潑尼松組 6 25.49±2.00 17.10±1.63 93.14±1.76 80.68±1.96豬苓組 6 30.03±1.34 27.96±1.08 104.63±1.26 92.35±2.03澤瀉組 6 30.20±1.16 27.75±1.26 103.28±2.19 93.19±1.74豬苓加澤瀉組 6 29.18±1.15 22.12±1.54 100.65±1.54 88.63±0.92

2×2析因設計分析及指標的相關分析：豬苓、茯苓及兩藥交互作用P＜0.05，說明豬苓、茯苓的使用對TGF-β1和TNF-α的影響是有差別的，而且兩藥之間存在交互作用，數(shù)據(jù)見表2。TGF-β1和TNF-α呈正相關（r=0.899，P＜0.05）。

表2 TGF-β1和TNF-α的2×2析因設計分析結果 （P值）

3 討 論

目前中醫(yī)對肺纖維化的研究正逐步深入，但對其病因病機的認識尚未統(tǒng)一，所用方藥雖有一定療效但很難形成統(tǒng)一的治療標準。治療多用益氣活血、化瘀祛痰、降逆利水、軟堅散結、溫補脾腎法［6-8］，但缺乏統(tǒng)一認識。肺纖維化病機多為虛實夾雜，肺失宣降，不能溫化、布散脾胃上輸之津液，水液內停；腎主納氣，腎氣不足，氣化失司，水液內停。而本病病程纏綿不愈，淡滲利濕藥物能利濕化痰、清痰之源，使水行而血行。豬苓味甘、淡，性平，功效利水滲濕。澤瀉味甘、淡，性寒味，功效利水滲濕、泄熱通淋。兩藥均可利濕化痰行水緩解咳、喘、憋等癥狀。

眾多學者認為，肺纖維化是由于各種外源性致病因子和自身體內病理因素引起肺組織炎性損傷，肺泡巨噬細胞（AM）活化，釋放TGF-β1、TNF-α、IL-1、IL-8、MCP-1等細胞因子以及其它趨化因子和黏附分子。另促進細胞因子和炎癥遞質的進一步分泌和表達，形成復雜的細胞因子網(wǎng)絡，引起肺泡炎和肺損傷。諸多因子中，TGF-β1［9］、TNF-α［10］在纖維化的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，其中TGF-β1是致纖維化的生長因子，在早期分泌增多，同時啟動肺纖維化的過程，形成不可逆性肺損傷。研究表明，在炎癥緩解或者組織修復階段，TGF-β1表達為受損上皮或實質細胞修復，但當其過量表達并引起其他細胞生長因子高表達時可引起纖維化。TNF-α作為重要的炎癥介質，促進炎癥反應和間質細胞的分化，并可通過與其他細胞因子的相互作用，在某種程度上直接或間接促進細胞外基質的合成。此外，TGF-β1、TNF-α［11］可通過直接或間接作用互相誘導產(chǎn)生，共同促進肺纖維化。

實驗結果顯示，豬苓組、澤瀉組、豬苓加澤瀉組、醋酸潑尼松組各時間點肺纖維化程度低于模型對照組，TGF-β1、TNF-α含量低于模型對照組。各給藥組與模型對照組均有顯著差異。醋酸潑尼松組的指標改善程度最為顯著，豬苓加澤瀉組次之，豬苓組及澤瀉組最弱。提示豬苓、澤瀉可以通過下調TGF-β1、TNF-α的表達減輕肺泡炎程度，豬苓、澤瀉合用效果優(yōu)于單用，從而抑制炎癥反應，減輕博來霉素對肺組織的致纖維化作用，從而延緩并減輕肺間質纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

［1］林慶艷，孫中關，楊俊玲.細胞因子在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用［J］.中國現(xiàn)代實用醫(yī)學雜志，2006，12（5）：37-40.

［2］趙永勝，陰素萍.益肺活血湯治療肺間質纖維化2l例［J］.陜西中醫(yī)，2008，29（4）：391-392.

［3］張曉梅，孫雪松，姜良鐸，等.芪紅湯治療特發(fā)性肺間質纖維化的臨床研究［J］.北京中醫(yī)藥大學學報（中醫(yī)臨床版），2007，14（1）：9-11.

［4］Henm es AR，Zaiman A，Champion HC.PDE5A inhibition atlenuates leomycin-induced pulmonary fibrosis and RhoA／Rho kinase activation［J］.Am J Physiol Lung Cell M ol Physiol，2008，294（1）：24-33.

［5］Kimua T，IshiiY，M orishma Y，et al.T reatment w ith alphagalacto aylcram ide the developm ent o f blem ycin-induced pulmonary fibrosis ［J］.J Immunol，2004，172（9）：5782-5789.

［6］張立山，戴雁彥，任傳云.武維屏教授治療肺纖維化十法［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15（4）：94-95.

［7］艾敏，陳新.周平安教授補氣活血法治療肺間質纖維化經(jīng)驗介紹［J］.新中醫(yī)，2009，41（8）：14-15.

［8］郭素芳.中醫(yī)藥療法在特發(fā)性肺纖維化治療中的應用［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15（2）：90-91.

［9］郝長付，姚武，吳逸明.TGF-β1在實驗性矽肺大鼠肺組織中的表達及其意義［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2006，27（7）：42.

［10］任平香，王獻化，蔣建姝，等.腫瘤壞死因子-α與肺纖維化［J］.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志，2007（11）：62.

［11］林慶艷，孫中關，楊俊玲.細胞因子在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用［J］.中國現(xiàn)代實用醫(yī)學雜志，2006，12（5）：37-40.

d s s］Pulmonary Fibrosis；Zhuling；Zexie；TGF-β1；TNF-α

R256.156.34

B

1004-2814(2013）04-236-03

周兆山

2013-01-08