杏酒中有機(jī)酸類化合物的RP-HPLC法測定

賀小賢， 彭光杰， 鄭茂奎， 趙會芳， 劉昌蒙， 孫福林

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

杏是一種營養(yǎng)價值較高的時令水果，具有多種營養(yǎng)功能和保健效果.有關(guān)分析表明杏果肉中含有糖類物質(zhì)約5%～17%，含氮類物質(zhì)約9%，礦物質(zhì)約0.37%～0.83%以及有機(jī)酸、維生素等物質(zhì)，因此具有預(yù)防維生素缺乏癥、防老抗衰、防癌抗癌及防止心血管疾病等多種藥理作用[1].利用陜西地區(qū)豐富的杏果資源，研究開發(fā)杏果發(fā)酵產(chǎn)品，通過微生物的發(fā)酵作用，杏果中的營養(yǎng)物質(zhì)和功能成分會轉(zhuǎn)移到產(chǎn)品中，賦予產(chǎn)品一定的營養(yǎng)作用，由于各種營養(yǎng)成分的存在，構(gòu)成了不同發(fā)酵產(chǎn)品特有的典型性[2,3].有機(jī)酸是一類含有羧基的化學(xué)物質(zhì)，具有抑菌、抗病毒、增加冠脈流量、抑制腦組織脂質(zhì)過氧化物生成、消炎、抗突變和抗癌等作用.杏酒中有機(jī)酸的種類、含量與杏酒的類型、品質(zhì)有直接的關(guān)系，影響杏酒的口感、色澤和生物穩(wěn)定性.因此, 有機(jī)酸的定性與定量分析不僅對杏酒中營養(yǎng)成分研究意義重大，而且在釀造食品生產(chǎn)過程質(zhì)量管理中也必不可少[4].近年來，人們逐漸關(guān)注杏酒中風(fēng)味物質(zhì)，但目前對杏酒中有機(jī)酸的研究報道還比較少.為了確定杏酒的風(fēng)味成分，建立杏酒典型的風(fēng)味特征，以期提高杏酒的質(zhì)量，因此對有機(jī)酸的檢測十分重要，反相高效液相色譜法是近幾年來發(fā)展較快的一種有機(jī)酸測定方法[5，6].利用反相高效液相色譜法對杏酒和杏醋中的有機(jī)酸進(jìn)行了分析和測定，結(jié)果可靠又穩(wěn)定.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、丁二酸、甲醇均為色譜純；磷酸、磷酸氫二鉀為分析純；實驗用水均為超純水.杏酒樣品、杏醋樣品實驗室制備.

Agilent 1100 Series 高效液相色譜儀、檢測器、恒溫箱、pH-3C型酸度計、移液槍等.

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm, 5μm)；流速:1 mL/min；檢測器波長:210 nm；流動相：2%的CH3OH-0.01 mol/L (NH4)2HPO4，用1 mol/L H3PO4調(diào)節(jié)pH至2.8, 柱溫:30 ℃.

1.3 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制

準(zhǔn)確稱取一定量的各種有機(jī)酸，分別用流動相溶解并定容至50 mL容量瓶中.配制一系列不同濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液.然后將上述標(biāo)準(zhǔn)液各取1 mL混合，用0.45 m的濾膜過濾后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.4 樣品的制備

取一定量的杏酒樣品至離心管中，6 000 r/min, 4 ℃離心20 min，取上清液經(jīng)0.45 m的針頭過濾器過濾后，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.5 測定方法

準(zhǔn)確移取各種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 L進(jìn)樣做色譜分析，然后，將9種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20L進(jìn)樣，根據(jù)每一種有機(jī)酸的保留時間，定性混合標(biāo)樣中不同種類的有機(jī)酸.然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用峰面積外標(biāo)法定量，加標(biāo)回收驗證.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的建立

2.1.1 檢測波長的確定

有機(jī)酸是一類含有羧基的化學(xué)物質(zhì)，一元有機(jī)酸因羧基中羰基氧和羥基氧上孤電子對的共軛作用，使其在205～215 nm 處有特征吸收峰；二元酸及多元酸中，除乙二酸外，其他酸的吸收峰在210 nm附近[7].為了確定各種有機(jī)酸的最大吸收波長，對不同組成的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在全波長(190 nm～600 nm)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果表明9種有機(jī)酸均在210 nm附近有較大的吸收峰，而流動相在210 nm處無吸收.因此選擇210 nm作為檢測器的測定波長.

2.1.2 流動相的選擇

液相色譜分析中，流動相的選擇至關(guān)重要，理想的流動相應(yīng)具有較高的純度、較低粘度和毒性、與檢測器兼容性好、對樣品的溶解適宜等特征.對反相色譜的流動相來說，通常水作為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等.極性調(diào)整劑的特性及其所占比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響[7].在有機(jī)酸的HPLC分析中, 甲醇-磷酸鹽緩沖溶液系統(tǒng)和甲醇-硫酸溶液系統(tǒng)是在反相C18柱中最為常用的兩種流動相[8,9]，在流動相中加入適量的甲醇可以使各組分的保留時間縮短,而且具有抑制拖尾、改善峰形[10,11]的效果.由于有機(jī)酸在水溶液中有較大的離解度，大部分是以離子形式在水相中存在，而酸根離子在反相色譜柱上幾乎不保留.使用色譜法分離杏酒中有機(jī)酸樣品時，采用反相離子抑制技術(shù)，即控制較大的酸度，使有機(jī)酸的解離反應(yīng)受到抑制，這時有機(jī)酸可在非極性的固定相C18柱上保留而得以分離.實驗中通過調(diào)節(jié)流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形.在分析研究大量相關(guān)文獻(xiàn)和多次預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，選擇合適的pH值，既有利于硅膠柱的鍵合相，又使各有機(jī)酸有適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r間，太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落.因此，在反相液相色譜分析中，流動相的pH值一般在2.5～7之間，在酸性(pH 2～3)流動相的條件下，酒石酸、蘋果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、丁二酸等有機(jī)酸的解離受到抑制，利用有機(jī)酸分子的疏水性，使其在色譜柱中保留.流動相的pH值高于或低于pKa兩個單位時，化合物中99%以一種形式存在，這種化合物才能獲得好的尖銳的峰[12].因此，實驗中選擇流動相的pH值分別為2.5、2.6、2.7、2.8、2.9進(jìn)行上樣，通過比較其對標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)在pH值為2.8時分離效果較好.因此，實驗確定以甲醇2%與98%的0.01 mol/L的(NH4)2HPO4緩沖液(pH 2.8)作為流動相，對杏果發(fā)酵產(chǎn)品中有機(jī)酸類化合物具有較好的分離效果.

2.1.3 有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以確定的流動相組成和檢測波長(210 nm)條件下，研究不同流速0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min對保留時間的影響.實驗結(jié)果表明，當(dāng)流速低于0.8 mL/min時，保留時間太長，很費時間；當(dāng)流速1.2 mL/min時，保留時間小于5分鐘，分離效果較差.綜合考慮多方面的因素，流速選擇1.0 mL/min、柱溫30 ℃條件下，對有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣檢測，實驗結(jié)果如圖1所示.

從圖1可以看出，9種有機(jī)酸均得到有效分離，其中草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸的保留時間分別為3.188 min、3.764 min、4.576 min、5.260 min、6.362 min、6.989 min、10.928 min、11.965 min、13.119 min，因此，該條件完全可以對樣品進(jìn)行定性分析.

2.2 有機(jī)酸線性回歸分析、精密度和回收率實驗

在上述最佳色譜條件下，對不同系列濃度(2.5μL、5μL、7.5μL、10μL、12.5μL)的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣品依次混樣進(jìn)樣分析，以峰面積外標(biāo)法定量，得到峰面積(Y)對9種有機(jī)酸進(jìn)樣體積(X)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù), 求得各成分的線性回歸方程以及線性范圍，計算出的相關(guān)系數(shù)均為0.99.同時，取同一杏果酒樣兩份，一份20μL進(jìn)樣，測定各有機(jī)酸含量(杏果酒樣品色譜圖如圖2所示)，同時對該樣品平行進(jìn)樣6次，考察方法的精密度；另一份與混標(biāo)按1∶1混合后，20μL進(jìn)樣，進(jìn)行回收率的測定，結(jié)果如表1所示.

1-草酸； 2-酒石酸； 3-丙酮酸; 4-蘋果酸; 5-乳酸;6-乙酸; 7-檸檬酸; 8-富馬酸; 9-琥珀酸 圖1 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸分析、回收率及精密度

由表1可以看出，除酒石酸、琥珀酸的相關(guān)系數(shù)小于0.999外，其余7種有機(jī)酸的相關(guān)系數(shù)均大于0.999，說明線性相關(guān)較好，可用于樣品測定.此外，樣品回收率除乙酸回收率稍低以外，其他有機(jī)酸的回收率均在90%以上，這主要是由于乙酸的揮發(fā)性造成了一定損失.RSD均在3%以下，由此說明該方法的重現(xiàn)性較好.總之，由該方法定量測定有機(jī)酸含量準(zhǔn)確、回收率高、精密度好，可進(jìn)行果酒、果醋中有機(jī)酸的定量測定.

2.3杏酒、杏醋中有機(jī)酸類化合物的含量分析

對杏酒、杏醋分別按樣品處理方法處理后，在最佳的色譜條件下，進(jìn)行反相高效液相色譜分析，樣品色譜圖如圖2、圖3所示，定量分析結(jié)果如表2所示.

圖2 杏酒有機(jī)酸色譜圖

圖3 杏醋有機(jī)酸色譜圖

對照有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜，圖2顯示不僅分離出本試驗所定性的9種有機(jī)酸，圖譜中還有多種未知峰出現(xiàn)，說明杏酒中除含有草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸9種有機(jī)酸外，還含有因微生物代謝而產(chǎn)生的其他有機(jī)酸.杏醋的色譜圖顯示，除丙酮酸未檢出以外，其他8種有機(jī)酸均存在，其中乙酸峰值最高，其他有機(jī)酸的含量均較低.此外，圖3中也含有未知峰，但種類少于杏酒，這主要是醋酸菌代謝造成的.為了更好的表明杏發(fā)酵產(chǎn)品有機(jī)酸的種類和含量.對杏酒和杏醋的色譜圖進(jìn)行面積外標(biāo)法定量，結(jié)果如表2所示.

表2 杏酒、杏醋中不同有機(jī)酸類化合物的含量

從表2可看出，杏酒中主要有機(jī)酸為檸檬酸，占總酸的37%，其次是乳酸和蘋果酸，還有少量的其他有機(jī)酸，這些有機(jī)酸，構(gòu)成了杏酒一定的酸味特點，對杏酒特征風(fēng)味也有一定的加成效應(yīng).杏醋中有機(jī)酸除主要含乙酸外，還有蘋果酸、檸檬酸、乳酸等，總酸含量明顯高于杏酒.說明不同的發(fā)酵過程，有機(jī)酸的代謝不同，因此對產(chǎn)品質(zhì)量的影響也不同.低分子量的有機(jī)酸是果酒和果醋中十分重要的一類化合物，它們的含量和分布反映了果酒和果醋的感官質(zhì)量、穩(wěn)定性和微生物活動的情況.在醋酸發(fā)酵過程中，由于好氧條件，丙酮酸進(jìn)入TCA環(huán)，完全氧化，充分反應(yīng)，所以在杏醋中均沒有檢出，杏醋樣品中，醋酸占總量的90%以上，是主要的酸類物質(zhì)，而草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸含量均有不同程度的下降，但實驗發(fā)現(xiàn)蘋果酸較果酒量高，其機(jī)理有待于進(jìn)一步探討.由于所分析的兩種樣品中，有很多未知峰出現(xiàn)，所以表2中顯示試樣的總酸較實際測定值要小一些.

3 結(jié)束語

建立了反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定杏酒中有機(jī)酸類化合物的方法，獲得最佳色譜條件.選用Agilent C18反相色譜柱；2%的甲醇-0.01 mol/L (NH4)2HPO4作為流動相，pH值控制2.8；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20μL；檢測器波長210 nm；柱溫30 ℃.在該條件下，可以較好地分離和定量測定杏酒中9種有機(jī)酸.除酒石酸、琥珀酸的相關(guān)系數(shù)小于0.999外，其余7種有機(jī)酸的相關(guān)系數(shù)均大于0.999，說明線性相關(guān)較好，可用于樣品測定.除乙酸回收率稍低以外，其他有機(jī)酸的回收率均在90%以上，RSD均在3%以下，由此說明該方法的重現(xiàn)性較好.總之，該方法操作簡單，能一次性分離多種有機(jī)酸類組分，且線性范圍良好、回收率高，分析結(jié)果準(zhǔn)確，可廣泛應(yīng)用于果酒有機(jī)酸的分析檢測及質(zhì)量控制中.

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