多孔陶瓷對粘細菌的吸附性能研究

龔國利， 劉麗麗， 王 娜， 游銀偉

(1.陜西科技大學 生命科學與工程學院， 陜西 西安 710021； 2.山東省農業(yè)科學院 高新技術研究中心， 山東 濟南 250100)

0 引言

微生物固定化技術是利用化學或物理方法將細胞或微生物固定于材料的限定空間內[1].目前的固定方法主要有包埋法、吸附法、交聯法，包埋法雖操作簡單但不適用于微生物固定，其應用仍停留在試驗階段[2].多孔陶瓷吸附固定微生物技術已成為研究熱點，尤其以無機材料為最.多孔陶瓷固定微生物主要借助于靜電作用，對多孔陶瓷進行酸堿或金屬鹽處理，可使其裸露出或吸附正離子，對微生物的吸附力加強[3].埃博霉素因其具有抗真菌和細胞毒活性，已成為研究的熱點[4,5].粘細菌作為埃博霉素的產生菌，如何提高其液體發(fā)酵產量是埃博霉素大規(guī)模生產的一大難題，若是以多孔陶瓷為載體對粘細菌進行吸附，可能會解決粘細菌液體發(fā)酵中聚團生長的難題[6]，提高埃博霉素產量.

本研究以粘細菌為試驗菌株，硅藻土基多孔陶瓷為載體，對多孔陶瓷的吸附性能進行觀察與試驗研究，并對多孔陶瓷吸附粘細菌的吸附條件進行優(yōu)化，為固定化粘細菌發(fā)酵制備埃博霉素提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 菌種

粘細菌SoF5-09，實驗室篩選并保藏.

1.2 多孔陶瓷制備

將硅藻土、煅燒硅藻土、粘土、石蠟按質量比40∶35∶15∶2稱量混合均勻，按粉料∶水=1∶10加入裝有球磨介質的實驗室球磨機(上海新諾QM1SP4行星式球磨機)300 r/min球磨30 min，80 ℃烘干打散后，加2% 40目木屑后混勻，噴灑5%蒸餾水制粒、陳腐后，壓片(5 MPa)成型，尺寸為Ф10×2 mm，300 ℃干燥4 h，并于1 000 ℃下煅燒30 min，獲得硅藻土基多孔陶瓷[7,8].制得多孔陶瓷的性能見表1.

表1 硅藻土基多孔陶瓷性能

1.3 多孔陶瓷處理

1.3.1 HCl處理多孔陶瓷

用0.2 mol/L HCl浸泡多孔陶瓷24 h后，傾去酸液用蒸餾水清洗，直至pH值接近中性.

1.3.2 FeCl3處理多孔陶瓷

以固液比1∶4的比例在多孔陶瓷中加入濃度為2 mol/L的FeCl3(pH=0.67)溶液，攪拌均勻后110 ℃烘干，每隔1 h攪拌一次，然后在馬弗爐中500 ℃煅燒3 h，室溫冷卻后用蒸餾水沖洗至無色后110 ℃烘干待用[9].

1.4 菌懸液制備

配制30 mL M26培養(yǎng)基于200 mL錐形瓶中，30 ℃ 200 r/min恒溫搖床培養(yǎng)3天；8 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，用30 mL蒸餾水重懸并打散菌體[10].同時采用干重法測定菌體濃度約為3.75 mg/mL.

1.5 吸附實驗

用硅藻土基多孔陶瓷對粘細菌進行吸附，按陶瓷和菌懸液比5 g∶100 mL，于30 ℃，100 r/min搖床條件下進行吸附試驗，每隔30 min取樣，測定多孔陶瓷吸附量.每次試驗重復3次，取其平均值以減少誤差.

1.6 分析方法

1.6.1 吸附量測定

將已吸附菌的多孔陶瓷于60 ℃烘干至恒重m0，再經600 ℃灼燒30 min后稱重m1，兩者之差(m0-m1)為多孔陶瓷吸附量.

1.6.2 紅外與電鏡分析

用德國Bruker V70傅里葉變換紅外光譜分析儀測定多孔陶瓷的FTIR圖譜.

將已吸附菌的多孔陶瓷用2.5 %戊二醛浸泡固定12 h，蒸餾水清洗3次，經30 %、50 %、70 %、85 %、95 %、100 %乙醇梯度脫水與乙酸異戊酯置換兩次后，進行冷凍干燥[11].用日立S-4800型掃描電子顯微鏡觀察硅藻土基多孔陶瓷的微觀形貌.

2 結果與討論

2.1 多孔陶瓷吸附性能

2.1.1 不同處理方法對多孔陶瓷吸附量的影響

圖1為多孔陶瓷、HCl處理的多孔陶瓷與FeCl3處理的多孔陶瓷隨時間變化對粘細菌吸附量的變化曲線.從中看出，3種多孔陶瓷的吸附量均在3.5～4 h時達到飽和狀態(tài)，且經FeCl3處理的多孔陶瓷對粘細菌的吸附量最高，主要是因為FeCl3處理多孔陶瓷的過程中，會轉化成Fe2O3顆粒并粘附在多孔陶瓷表面，可中和陶瓷表面原有的負電荷，使其表面呈中性或帶正電[9]，可有效地吸附帶負電性的細菌.因此，本實驗條件下，使用經FeCl3處理的多孔陶瓷進行粘細菌吸附試驗較好.

2.1.2 FeCl3處理濃度選擇

圖2為不同濃度FeCl3處理的多孔陶瓷隨時間變化對粘細菌吸附量的變化曲線.隨著濃度增加，吸附量也隨之增加，可能是因為粘附的Fe2O3越來越多的緣故；當FeCl3濃度為2.5 mol/L時，對粘細菌的吸附量與經2.0 mol/L FeCl3處理的多孔陶瓷的吸附量相差不大，可能是已達到吸附飽和的緣故.本實驗條件下，選擇2.0 mol/L FeCl3處理多孔陶瓷.

圖1 不同處理多孔陶瓷對粘細菌吸附量變化

圖2 不同濃度FeCl3處理多孔陶瓷對粘細菌吸附量變化

2.1.3 多孔陶瓷的FTIR譜分析

圖3為硅藻土基多孔陶瓷與經FeCl3處理的多孔陶瓷的FTIR譜分析結果.圖中480 cm-1附近處為Fe2O3的吸收峰，1 130 cm-1附近處為Si-O-Si的吸收峰[12]，且經FeCl3處理的多孔陶瓷在這兩處的吸收峰明顯加強，說明Fe2O3含量、Si-O-Si鍵增多；在1 600 cm-1、3 500 cm-1附近處為O-H的振動峰[13]，經FeCl3處理的多孔陶瓷在這兩處的振動明顯降低，可能是因為在處理過程中破壞了多孔陶瓷表面的結合水.這說明經FeCl3處理的多孔陶瓷在吸附粘細菌時有著更強的吸附作用.

圖3 多孔陶瓷的FTIR圖譜

2.1.4 多孔陶瓷的微觀形貌

粘細菌細胞柔軟，一般呈桿狀，如圖4(a)所示，本實驗所培養(yǎng)的粘細菌長約3～5μm，寬約1μm，且粘細菌無鞭毛，可分泌粘液，采用滑動行為形成薄而擴展的菌落[14].這種粘液可能有利于多孔陶瓷對粘細菌的吸附固定.本實驗室自制的硅藻土基多孔陶瓷孔徑約5～10μm，經FeCl3處理的多孔陶瓷表面及孔徑內覆蓋有一層納米級Fe3O2顆粒(圖4(c)).在經過吸附試驗后，可以看出陶瓷孔隙內有大量的粘細菌存在(圖4(d))，說明所制的多孔陶瓷可以作為粘細菌的吸附載體.

圖4 樣品的SEM圖

2.2 吸附條件的研究

2.2.1 溫度對吸附量的影響

圖4為FeCl3處理的多孔陶瓷在不同溫度，100 r/min搖床條件下經吸附4 h后吸附量的變化.

由圖可知，隨著溫度上升吸附量隨之增加，在30 ℃時達到最高，即11.85 mg/g.這可能是因為粘細菌在30 ℃左右最為活躍，且溫度的上升有利于粘細菌向多孔陶瓷表面及孔徑內擴散.在35 ℃時吸附量急速下降，這可能是因為過高的溫度使吸附的菌體不穩(wěn)定，易脫落.因此在本實驗條件下，吸附溫度應在30 ℃.

2.2.2 轉速對吸附量的影響

圖5為FeCl3處理的多孔陶瓷在30 ℃不同轉速條件下經吸附4 h后的吸附量變化.隨著轉速的增大，吸附量隨之增加，因為轉速的增加可加快粘細菌與多孔陶瓷的接觸機會，但過高的轉速也會增加多孔陶瓷間的摩擦碰撞，易使已吸附菌體掉落.因此在在本實驗條件下，轉速應在100 r/min.

圖5 溫度對吸附量的影響

圖6 轉速對吸附量的影響

2.2.3 吸附條件優(yōu)化

本實驗采用正交設計法，進一步探討溫度、轉速、吸附時間對多孔陶瓷吸附粘細菌的影響.以吸附量為指標，選用L9(34)表安排實驗，確定最優(yōu)吸附工藝.吸附試驗采用的因素與水平見表2，實驗結果見表3.

表2 L9(34)因素水平表

由表3、4可知，溫度、轉速這兩個因素對吸附量的影響較大，主次次序是轉速、溫度、吸附時間，最優(yōu)方案是A2B2C1，即在30 ℃、100 r/min條件下吸附3.5 h吸附量效果最好.經驗證后，吸附量達14.45 mg/g.

表3 正交試驗結果

表4 方差分析結果

3 結論

將硅藻土基多孔陶瓷作為粘細菌的固定載體是可行的.研究表明，在經2.0 mol/L FeCl3處理的硅藻土基多孔陶瓷對粘細菌的吸附效果較好，吸附4 h后吸附量達10.6 mg/g；在對吸附試驗的溫度、轉速、吸附時間進行優(yōu)化后，當溫度為30 ℃、轉速為100 r/min、吸附時間為3.5 h時吸附量最大，達14.45 mg/g.為下一步多孔陶瓷固定粘細菌發(fā)酵制備埃博霉素提供實踐基礎.

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