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    飼料中芽孢桿菌的檢測(cè)及存在問題的分析

    2013-01-30 01:55:14劉洪斌侯東軍楊紅菊田曉玲姜艷彬
    中國畜牧獸醫(yī)文摘 2013年1期
    關(guān)鍵詞:枯草芽孢生理

    劉洪斌 侯東軍 楊紅菊 田曉玲 馬 帥 姜艷彬 王 海 于 雷*

    (1.農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,北京 100125;

    2.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心,沈陽 110016)

    飼料中芽孢桿菌的檢測(cè)及存在問題的分析

    劉洪斌1侯東軍1楊紅菊1田曉玲2馬 帥2姜艷彬1王 海1于 雷1*

    (1.農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,北京 100125;

    2.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心,沈陽 110016)

    本研究通過對(duì)飼料樣品中的芽孢桿菌檢測(cè),發(fā)現(xiàn)目前國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26428-2010《飼料微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)》中存在的一些問題:即通過國標(biāo)方法鑒定,該飼料中的添加劑為枯草芽孢桿菌,而通過常規(guī)菌種鑒定的16S rDNA序列測(cè)定和生理生化指標(biāo)分析,無法判定該結(jié)果。經(jīng)過分子生物學(xué)方法,鑒定該細(xì)菌為解淀粉芽孢桿菌。作為暫時(shí)未經(jīng)許可應(yīng)用于飼料添加劑的解淀粉芽孢桿菌,以目前的國標(biāo)方法還無法檢出,本研究為探索其檢測(cè)方法提供了一些建議。

    飼料 微生物添加劑 芽孢桿菌 檢測(cè)方法

    微生物飼料添加劑又稱益生素,是當(dāng)攝入量足夠時(shí)能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有益作用的活性微生物(FAO,WHO,2001),微生物飼料添加劑具有維護(hù)動(dòng)物腸道健康、緩解不良應(yīng)激、改善畜舍環(huán)境、調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪代謝和改善畜產(chǎn)品品質(zhì)的功能。還有研究者認(rèn)為,微生物飼料添加劑具有替代抗生素功能的作用(徐鵬等,2012)。

    在國外,早在20世紀(jì)60年代開始使用益生菌作為人類保健食品和飼料微生物添加劑,20世紀(jì)70年代美國、歐洲就有飼料微生物添加劑上市(何月英等,2005)。1989年美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料公定協(xié)會(huì)(AAFCO)公布了44種“可直接飼喂且通常認(rèn)為是安全的微生物” 作為微生態(tài)制劑的出發(fā)菌株。1999年6月,我國農(nóng)業(yè)部第105號(hào)文件發(fā)布的《允許使用的飼料添加劑品種目錄》,共計(jì)12種微生物,其中芽孢桿菌屬包括枯草芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌;2003年農(nóng)業(yè)部第318號(hào)公告中規(guī)定了14種允許使用的微生物,地衣芽孢桿菌列入,但納豆芽孢桿菌未列入;2006年農(nóng)業(yè)部658號(hào)公告規(guī)定了16種允許使用的微生物,芽孢桿菌屬包括枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌;2008年12月我國農(nóng)業(yè)部1126號(hào)公告規(guī)定了16種允許使用的微生物,芽孢桿菌屬依舊僅有枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。

    本研究通過對(duì)飼料樣品芽孢桿菌的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)目前的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26428- 2010《飼料微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)》中存在的一些問題,其不能有效的區(qū)分枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌,并提出了相應(yīng)的改進(jìn)方案。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    細(xì)菌染色體DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Mastermix、DL2000核酸分子量Marker、100bp DNA Ladder購自天根生化科技(北京)有限公司;營養(yǎng)瓊脂、LB培養(yǎng)基等購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成;DNA測(cè)序由北京華大基因研究中心完成;API 50CHB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)購自生物梅里埃中國有限公司。有機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 飼料樣品芽孢桿菌的檢測(cè)

    主要依照GB/T 26428-2010《飼料微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)》進(jìn)行飼料中枯草芽孢桿菌的檢測(cè),并進(jìn)行了少量的修改:菌落計(jì)數(shù)中,將芽孢桿菌的培養(yǎng)時(shí)間由48±2 hr縮短至18-20hr。

    1.3 16S rDNA的克隆及序列測(cè)定

    挑取3株通過GB/T 26428-2010方法分離得到的平皿單菌落,在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜,各取5mL 菌液提取染色體DNA,電泳定量后,用引物AD007 和AD008 進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系50μL:上游引物2μL(10mM),下游引物2μL(10mM),模版1μL(約50ng),2×Taq PCR Mastermix 25μL,超純水20μL。擴(kuò)增條件:94 ℃,5 min;94 ℃,30 s;54 ℃,30 s;72℃,90 s;重復(fù)2~4 步驟,進(jìn)行29 個(gè)循環(huán);72℃,10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定,以引物AD007 和AD008 進(jìn)行測(cè)序,在NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對(duì)。

    1.4 生理生化測(cè)定

    將測(cè)序的3株細(xì)菌進(jìn)行生理生化測(cè)試,分別取平皿單菌落,懸浮于10 mL 的API 50CHB培養(yǎng)基中,加入API 50CHB測(cè)試板中,37℃培養(yǎng)48 h后觀察,與判讀表比對(duì)獲取生理生化信息。

    1.5 枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌的分子生物學(xué)鑒定

    根據(jù)兩篇文獻(xiàn)(劉勇等,2010;曹鳳明等,2008)報(bào)道的方法進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定并進(jìn)行了小量修改,引物序列見表1。擴(kuò)增體系50μL:上游引物2μL(10mM),下游引物2 μL(10 mM),模版1 μL(約50 ng),2×Taq PCR Mastermix 25μL,超純水20μL。擴(kuò)增條件:94 ℃,5 min;94 ℃,30 s;60 ℃,30 s;72 ℃,60 s;重復(fù)2-4 步驟,進(jìn)行29 個(gè)循環(huán);72℃,10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定,以相應(yīng)引物進(jìn)行測(cè)序,在NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對(duì)。

    表1 試驗(yàn)選擇的引物對(duì)

    2 結(jié)果與分析

    2.1 飼料樣品的芽孢桿菌檢測(cè)(國標(biāo)方法)

    將飼料樣品梯度稀釋后,涂布于營養(yǎng)瓊脂平板中,37℃培養(yǎng)18hr后計(jì)數(shù)。在稀釋倍數(shù)為106的3個(gè)平板中,其菌落數(shù)分別為39、41和49個(gè)。

    取5個(gè)菌落進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn),5株菌表面粗糙、不透明,灰白色;革蘭氏染色陽性,鏡檢細(xì)胞為桿狀,有芽孢,符合枯草芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)要求。

    按照GB/T 26428-2010進(jìn)行了5株菌的7%氯化鈉生長、V-P實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、丙酸鹽利用實(shí)驗(yàn)和D-甘露醇產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)。5株菌的生理生化指標(biāo)相同,其結(jié)果如表2所示。

    表2 飼料樣品中芽孢桿菌生理生化指標(biāo)(國標(biāo)方法)

    根據(jù)菌落形態(tài)、染色鏡檢及生理生化指標(biāo),通過GB/T 26428-2010判斷該飼料樣品中的含有芽孢桿菌,其含量為為4.3×107cfu/g。

    2.2 16S rDNA序列測(cè)定

    挑取3株通過GB/T 26428-2010分離得到的平皿單菌落,以引物AD007、AD008進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增,在1%的瓊脂糖凝膠中電泳鑒定,其擴(kuò)增產(chǎn)物均為1600bp條帶(圖略)。

    取擴(kuò)增產(chǎn)物,以AD007、AD008為測(cè)序引物,進(jìn)行核酸序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì),3個(gè)菌落PCR獲得的序列相同,其16S rDNA的序列與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌中的多株菌同源性達(dá)到98%(如圖1所示),可以判斷其為芽孢桿菌屬。

    圖1 芽孢桿菌的16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果

    2.3 生理生化測(cè)定

    根據(jù)16S rDNA測(cè)序結(jié)果,選用適合于芽孢桿菌的API 50 CHB試劑盒進(jìn)行各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定,在37℃溫箱中培養(yǎng)48 h后,3株菌的生理生化指標(biāo)相同,與判讀表比對(duì)獲得生理生化指標(biāo)如表3所示。

    經(jīng)軟件分析,該細(xì)菌為枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌,可信度為99%,但無法確定該細(xì)菌為枯草芽孢桿菌。

    2.4 枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌的分子生物學(xué)鑒定

    根據(jù)16S rDNA序列測(cè)定及API 50CHB的生理生化指標(biāo),為了進(jìn)一步判斷該細(xì)菌,參考了文獻(xiàn)中報(bào)道的兩種分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。

    通過解淀粉芽孢桿菌的2對(duì)引物對(duì)擴(kuò)增,在2%瓊脂糖凝膠電泳中分別獲得了736 bp和1 275 bp的條帶,與文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果相同,而通過枯草芽孢桿菌的2對(duì)引物對(duì)均為獲得任何擴(kuò)增條帶(圖略)。

    將擴(kuò)增出的條帶測(cè)序,通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì),結(jié)果表明,兩組測(cè)序結(jié)果均與解淀粉芽孢桿菌有很高的同源性,而與枯草芽孢桿菌的同源性很低,如圖2和圖3所示。

    表3 芽孢桿菌的API 50CHB生理生化指標(biāo)

    圖2 芽孢桿菌特異性基因序列比對(duì)結(jié)果1

    圖3 芽孢桿菌特異性基因序列比對(duì)結(jié)果2

    3 討論

    3.1 現(xiàn)存國標(biāo)存在的問題

    目前應(yīng)用于飼料中枯草芽孢桿菌檢測(cè)的最新國標(biāo)為GB/T 26428- 2010《飼料微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)》,其在檢測(cè)時(shí)存在以下兩點(diǎn)問題:

    (1)芽孢桿菌生長迅速,最佳培養(yǎng)條件下每20 min即繁殖1代。在使用國標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)時(shí),37℃培養(yǎng)48 h,菌落直徑可以達(dá)到1 cm以上,按照標(biāo)準(zhǔn)中要求每個(gè)平板30~300個(gè)菌落,普通的90 cm平皿幾乎鋪滿,很難進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果改為培養(yǎng)時(shí)間為18 h,則菌落較小,適于計(jì)數(shù)操作。

    (2)在目前的國標(biāo)中,暫無法對(duì)枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行區(qū)分,而后者暫時(shí)沒有列在允許使用的飼料添加劑名單中。

    3.2 枯草芽孢桿菌的鑒定

    枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)是在進(jìn)化上親緣關(guān)系較為接近的芽孢桿菌(Robert MS,1994),這些菌從形態(tài)學(xué)到生理生化特征存在很多相同之處,在鑒定或檢測(cè)中很難準(zhǔn)確區(qū)分(東秀珠等,2001)。

    芽孢桿菌最常用的鑒別方法為生理生化法,通過梅里埃的API 50CHB或Biolog的GEN III鑒定板均可以快速、準(zhǔn)確的獲得一系列指標(biāo)進(jìn)行鑒定,但其在有些芽孢桿菌區(qū)分鑒定中還存在一些局限性,例如枯草芽孢桿菌/解淀粉芽孢桿菌的鑒定、蘇云金芽孢桿菌/蠟樣芽孢桿菌/蕈狀芽孢桿菌的鑒定。對(duì)于這些無法通過生理生化指標(biāo)鑒定的菌種,通過分子生物學(xué)進(jìn)行輔助鑒定,將能夠更準(zhǔn)確的進(jìn)行芽孢桿菌的鑒定。

    3.3 工業(yè)微生物菌種鑒定存在的問題

    除了芽孢桿菌外,還有很多用于工業(yè)生產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖、環(huán)境保護(hù)等方面的細(xì)菌,由于這些菌種經(jīng)過了選育,在某一方面具有特殊的形狀,造成了其可能在生理生化指標(biāo)方面與天然菌株存在一定的差異。

    本研究中的解淀粉芽孢桿菌,可以在10%的NaCl培養(yǎng)基中生長;在生產(chǎn)廠家給出的鑒定報(bào)告中,對(duì)照菌株解淀粉芽孢桿菌KCCM不能再10%的NaCl培養(yǎng)基中生長,因此判定本研究中的細(xì)菌為枯草芽孢桿菌,結(jié)論有些武斷。

    通過全基因組測(cè)序,進(jìn)行序列比對(duì)是最準(zhǔn)確的菌種鑒定方法,但對(duì)成本和時(shí)間的要求都很高。但對(duì)于使用價(jià)值較高,已經(jīng)有相同模式菌全基因組序列的工業(yè)生產(chǎn)菌來說,還是事半功倍的,其在避免生理生化指標(biāo)產(chǎn)生誤區(qū)時(shí),也排除了普通分子生物學(xué)檢測(cè)中菌體攜帶質(zhì)粒造成的誤判。

    [1] 曹鳳明,沈德龍,李俊,等.應(yīng)用多重PCR鑒定微生物肥料常用芽孢桿菌[J].微生物學(xué)學(xué)報(bào),2008,48(5):651-656.

    [2] 東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

    [3] 何月英,寧玲忠,曾德年,等.飼料微生物添加劑的研究[J].湖南畜牧獸醫(yī),2005(3):3-5.

    [4] 劉勇,李輝,李金霞,等.特異PCR方法對(duì)枯草芽孢桿菌群的鑒定區(qū)分[J].飼料工業(yè),2010,31(4):52-54.

    [5] 徐鵬,董曉芳,佟建明.微生物飼料添加劑的主要功能及其研究進(jìn)展[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2012,24(8):1397-1403.

    [6] FAO,WHO.Report of a joint FAO /WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria[M].Cordoba:Argentina,2001.

    [7] Robert MS,Nakamura LK,Cohan FM.Bacillus mojavensis sp.nov.,distinguishable from Bacillus subtilis by sexual isolation,divergence in DNA sequence,and differences in fatty acid composition[J].Int J Syst Bacteriol,1994,44(2):256-264.

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