殼聚糖/明膠磁性微球的反相懸浮乳液包埋法制備研究

宋宏新， 李 韻， 薛海燕， 賀寶元

(1.陜西科技大學 生命科學與工程學院， 陜西 西安 710021； 2.陜西科技大學 資源與環(huán)境學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

磁性微球是通過將磁性粒子與有機高分子結合，形成具有一定磁性及特殊結構的復合微球.用它來進行目標物分離,具有操作簡單、高效快速、可重復使用、保持靶物質(zhì)生物活性等特點.磁性微球分離技術廣泛用于醫(yī)學抗癌導向、生物物質(zhì)分離及食品檢測等，是生物分離技術的一次革命，有力地推動了醫(yī)學和生物學研究的發(fā)展[1-3].

磁性微球的制備方法主要有包埋法、單體聚合法、共沉淀法和化學沉淀法等[4].磁性微球的制備一直是一個技術難點，高質(zhì)量磁性微球主要依靠進口國外高價產(chǎn)品，大大限制了磁性微球在國內(nèi)生物醫(yī)學研究領域的應用[5].本研究在綜合比較各種制備方法的基礎上，研究了制備高質(zhì)量磁性微球的優(yōu)化工藝方法.

1 實驗材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑：液體石蠟(化學純)，相對密度0.835～0.855;Span-80(化學純)皂化價145～185；殼聚糖(BETTER)，脫乙酰度95.7%，分子量775 Kda，等電點為4.7；明膠(西安舟鼎國生物技術有限責任公司)，約225水華，平均分子量50,000，每100 g有100～150 mmol羧基基團，含水量13.7%，等電點為4.7～5.2；磁性粒子(南京共達納米應用研究所)，F(xiàn)e3O4質(zhì)量百分比含量大于95%，平均粒徑20 nm左右，最大磁飽和強度為3千高斯；戊二醛(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)，濃度為25%和50%；親和層析多克隆兔抗雞IgG(實驗室制備).

儀器：752型紫外-可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；機械攪拌機(IKA)；掃描電鏡(S-2700，日本日立集團).

1.2 實驗過程

1.2.1 磁性微球的制備

(1)制備水相.稱取0.2 g明膠、0.3 g殼聚糖和0.1 g磁性粒子，加入10 mL蒸餾水，70 ℃水浴邊攪拌邊加入100μL冰醋酸，待殼聚糖和明膠完全溶解并與磁性粒子混合均勻后，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH到4.5～7.0[6]，得到2%明膠-3%殼聚糖-1%磁性粒子的復合溶液，室溫備用.

(2)油水乳化.向三口燒瓶中加入20 mL液體石蠟和0.6mL span-80,60 ℃恒溫水浴625 r/min攪拌混合30 min后,向其中逐滴加入5 mL水相樣品，進行乳化.

(3)固化微球.乳化10 min后，同轉速下改換4 ℃冰浴，使乳液迅速降溫，使水相凝固初步定形成球.降溫2 min后逐滴一次加入0.5 mL戊二醛交聯(lián)30 min.逐漸升高水浴溫度到30 ℃，繼續(xù)固化反應90 min[7-9].反應結束后，乳液分別用石油醚、丙酮、異丙醇2 000 r/min反復洗滌后，避光自然晾干，得到褐色粉末.

1.2.2 磁性微球表征

(1)形貌表征.對磁性粒子進行掃描電子顯微鏡(SEM)的拍攝，觀察殼聚糖/明膠磁性微球的大小、分散性和表面形貌.

(2)磁響應測定.每0.02 g磁性微球溶于pH 7.0的蒸餾水中，低溫超聲振蕩混勻2 h，在磁力架上靜置30 min，清液在420 nm處測吸光度A.A<0.05為磁響應良好[10].

1.2.3 磁性微球吸附BSA

按照表1，分別加入0.02 g/mL混勻的磁性微球溶液(pH7.0)、100μg/mL BSA和蒸餾水在1～6號離心管中， 37 ℃振蕩2 h使BSA充分吸附在磁性微球表面，用磁力架分離磁性微球30 min，取清液用考馬斯G250法測定595 nm處吸光度，計算蛋白質(zhì)含量，確定BSA最佳加入量和吸附率[11].

表1 磁性微球對BSA的吸附

1.2.4 磁性微球吸附親和層析兔抗β-CNIgG

同樣地按照表1，僅將100μg/mL BSA換成層析純化多克隆兔抗β-CNIgG,其它操作同前，計算親和層析兔抗β-CNIgG最佳加入量和吸附率.

最佳親和層析兔抗β-CNIgG加入量和磁性微球進行混合37 ℃振蕩反應2 h，4 ℃放置6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后分別取清液，用考馬斯G250法在595 nm處測定吸光度，確定磁性微球對抗體的吸附穩(wěn)定性.

2 結果與討論

2.1 SEM電鏡

2.1.1 制備得到的殼聚糖/明膠磁性微球的SEM照.

如圖1(a)可以看到微球成球效果較好，表面光滑無凹陷，分散性好，球與球間粘連少.但也可以看到微球大小不夠均勻，制備方法還有待于改善；圖1(b)中微球表面光滑無凹陷，與標尺比對得到制備的磁性微球粒徑在3～8μm之間.微球上出現(xiàn)了一些白色亮點，這是由于微球內(nèi)部磁性Fe3O4粒子與噴金表面有不同的電荷密度，電鏡對兩者感光度不同，使照片中微球上出現(xiàn)白色亮點，證實了磁性粒子被包裹在微球內(nèi)部.結果表明反相懸浮乳液包埋法可以制備形貌較好的磁性微球.

2.1.2 戊二醛濃度對殼聚糖/明膠磁性微球制備的影響

25%和50%的兩種不同濃度的戊二醛對比制備的磁性微球的SEM照片如圖2所示.

(a)600倍 (b)1000倍圖1 殼聚糖/明膠磁性微球的SEM形貌

(a)25%的戊二醛100倍 (b)50%的戊二醛100倍 (c)25%的戊二醛450倍 (d)50%的戊二醛450倍圖2 不同濃度戊二醛制備的殼聚糖/明膠磁性微球的SEM形貌

圖2(a)可以明顯看到25%戊二醛制備得到的磁性微球分散性較好，大小較為均勻，相比之下圖2(b)50%戊二醛制備的產(chǎn)物異形團聚物較多，分散性不好；圖2(c)中25%戊二醛制備的微球成球性好、表面光滑粘連少；圖2(d)的產(chǎn)物成球性不好，非球形個體較多，箭頭所指處表面凹陷粘連嚴重.

結果表明，25%戊二醛制備得到的磁性微球形貌更好.

2.2 磁響應效果

制備的磁性微球的磁響應性是對其表征的重要指標之一.選取了最優(yōu)制備條件下的3個樣品和3個溫度進行磁響應性的測定，結果如表2所示.

表2 殼聚糖/明膠磁性微球磁響應性結果

從表2中可以看出,3個樣品在3個溫度的下吸光度A<0.05.其中，在4 ℃和20 ℃時，吸光度較低，表明磁性微球在低溫時磁響應較穩(wěn)定；40 ℃時，吸光度略有升高，是因為部分微球中未交聯(lián)的明膠在升溫后溶解，破壞了微球結構，使其失去磁性粒子后漂浮于溶液中，溶液吸光度略有上升，但均未超過0.05，表明40 ℃時磁性微球穩(wěn)定性較好.

磁響應性實驗結果表明，制備得到的磁性微球磁響應效果好.

2.3 磁性微球吸附蛋白質(zhì)效果

2.3.1 吸附BSA

對3個磁性微球樣品進行了BSA吸附效果的實驗，結果如圖3所示.

圖3顯示BSA加入量在0～40μg/mL范圍內(nèi)時，吸附于磁性微球表面的BSA量，隨著BSA加入量增加而增加.當BSA加入量為40μg/mL時出現(xiàn)了拐點，繼續(xù)增加加入量，吸附量趨于穩(wěn)定不再出現(xiàn)明顯增加.故40μg/mL為0.02 g/mL的磁性微球的最佳BSA加入量.通過公式：吸附率 =[(總加入量-上清液含量)/總加入量]×100%，可計算出BSA的吸附率為86.25%，吸附量為34.5±0.6μg/mL.

結果表明，制備得到的磁性微球對BSA有較好的吸附效果.

圖3 磁性微球對BSA的吸附情況

2.3.2 吸附層析兔抗β-CNIgG

對3個磁性微球樣品進行了IgG吸附效果的實驗，結果如圖4所示.

圖4 磁性微球對IgG的吸附情況

圖4顯示IgG加入量在0～40μg/mL范圍內(nèi)時，磁性微球對IgG的吸附量，隨著IgG加入量增加而增加.當加入量在40～60μg/mL范圍內(nèi)時，吸附量的增加不明顯，40μg/mL為曲線拐點，故40μg/mL為0.02 g/mL的磁性微球的最佳IgG加入量.同樣用吸附率公式可以計算出IgG的吸附量為19.6±1.0μg/mL吸附率為49.31%.

結果表明，制備得到的磁性微球對IgG有較好的吸附效果.

2.3.3 免疫殼聚糖/明膠磁性微球的時間穩(wěn)定性

免疫磁性微球的時間穩(wěn)定性結果如圖5所示.

圖5 時間變化對免疫磁性微球的穩(wěn)定性的影響

圖5顯示，靜置時間在0～24 h范圍內(nèi)，未吸附牢固的抗體進入清液，清液中的IgG量隨時間延長明顯增加.在24～72 h范圍內(nèi)，清液中的IgG量隨著時間的延長增加不明顯，48 h時清液中IgG的增加量第一次低于總加入量的1%，可以認為此時IgG與微球的吸附已經(jīng)趨于穩(wěn)定，48 h時IgG的吸附率為42.75%.

3 結論

本實驗成功制備得到了粒徑在3～8μm的表面光滑、分散性好的殼聚糖/明膠磁性微球.磁性微球穩(wěn)定性較好，在高速離心和靜置多日的情況下均未發(fā)生聚沉；25%戊二醛制備的磁性微球形貌較好；制備的磁性微球磁響應在4 ℃和20 ℃下均良好；磁性微球對BSA有較好的吸附效果，0.02 g/mL的磁性微球最佳的BSA加入量為40μg/mL，吸附率可以達到86.25%；磁性微球對層析兔抗β-CNIgG有較好的吸附效果，最佳加入量為40μg/mL，吸附率可以達到49.31%；制備的免疫磁性微球在48 h后趨于穩(wěn)定，最終IgG吸附率為42.75%.

本試驗制備磁性微球時，向油相中加入水相(磁粒子分散于殼聚糖/明膠溶液中)，通過調(diào)整兩相組分的比例，控制合適的攪拌速度是水相充分乳化穩(wěn)定的關鍵，其次是在固化交聯(lián)前對乳液快速降溫(4～7 ℃)使明膠凝固，使球體形狀初步固化成形，可以減少微球粘連和異形球體的出現(xiàn)；另一關鍵點是，戊二醛使殼聚糖分子間交聯(lián)，合適濃度的戊二醛理想情況是使球體表面交聯(lián)成殼，形成表面光滑、分散性較好的微球，濃度過大會使交聯(lián)過快出現(xiàn)球體表面凹陷、球體異形及球體間粘連等現(xiàn)象.

本實驗僅對交聯(lián)劑進行了研究，取得了階段性結論，其他影響乳化體系的復雜因素還值得進一步探討.

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