木質(zhì)素降解菌的篩選及產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

張安龍， 王桂秋， 杜 飛， 龔國利

(1.陜西科技大學(xué) 輕工與能源學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

木質(zhì)素(Lignin)是植物組織的主要成分之一，是自然界中僅次于纖維素的第二大有機(jī)物.它廣泛存在于高等植物細(xì)胞中，是針葉木、闊葉木和草類植物的基本化學(xué)組成，約占其化學(xué)組成的15%～30%[1].木質(zhì)素的分子結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，主要由苯丙烷單元通過醚鍵和碳鍵等多種共價鏈連接而成，是一種無規(guī)則的、非水溶性的、三維網(wǎng)狀的芳香族高分子聚合物[2].由于木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，不規(guī)則性和含有多種穩(wěn)定的鍵型結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其很難降解.此外，木質(zhì)素與半纖維素包裹在纖維素的周圍，從而影響了對纖維素的降解及分離.

白腐菌是一類具有使木質(zhì)纖維素產(chǎn)生白色腐爛功能的絲狀真菌的總稱，是木腐真菌(wood rotting fungi)中對木質(zhì)素的降解能力最強(qiáng)的成員，是已知的能在純培養(yǎng)條件中，將木質(zhì)素徹底降解為CO2和H2O的唯一一類生物[3].白腐菌對木質(zhì)素的降解是由其產(chǎn)生的胞外酶，木質(zhì)素過氧化物酶，錳過氧化物酶及漆酶來實(shí)現(xiàn)的，其降解過程是以自由基為基礎(chǔ)的鏈反應(yīng)過程，具有高度的非特異性和立體選擇性[4].由于白腐菌對木質(zhì)素及芳香族類難降解化合物的獨(dú)特的降解作用，近些年已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但長期以來，人們對白腐菌的研究僅局限于黃孢原毛平革菌，變色栓菌等少數(shù)菌屬，在這些菌屬的應(yīng)用研究中，往往無法滿足白腐菌對木質(zhì)素降解的理想培養(yǎng)條件，而且不同菌屬的白腐菌對木質(zhì)素的降解效率，產(chǎn)酶的種類和活性，以及環(huán)境條件的要求，也因菌種的不同而有很大的差異.因此,從自然環(huán)境中分離獲得更豐富的白腐菌菌種，篩選得到在較寬泛環(huán)境條件下對木質(zhì)素具有高降解效率的白腐菌，對白腐菌在實(shí)踐中的應(yīng)用，具有重大的現(xiàn)實(shí)意義.

本文通過對采集的菌種分離純化，綜合愈創(chuàng)木酚平板和鞣酸平板的變色反應(yīng)篩選得到降解木質(zhì)素能力強(qiáng)的菌株.通過菌絲形態(tài)的顯微鏡觀察，初步確認(rèn)該菌株為白腐菌.然后經(jīng)過對菌株液體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而得到該菌株液體培養(yǎng)產(chǎn)漆酶的最佳培養(yǎng)條件.

1 材料和方法

1.1 菌種

待篩選的菌株均采集于西安市未央湖公園，城市運(yùn)動公園，及陜西科技大學(xué)校園內(nèi)，從腐敗的樹枝，帶有白色菌點(diǎn)的樹皮上獲取目標(biāo)菌種.

1.2 培養(yǎng)基及溶液

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出液200 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加自來水至1 000 mL.

分離純化培養(yǎng)基：麥芽膏粉5 g，蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，鄰苯基苯酚0.01 g，瓊脂20 g，加自來水至1 000 mL.

保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出液200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加自來水至1 000 mL.

初篩培養(yǎng)基：愈創(chuàng)木酚0.1 g，葡萄糖10 g，酒石酸銨0.2 g，蛋白胨2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， KH2PO41.5 g，瓊脂20 g，加自來水至1 000 mL.

鞣酸變色培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出液100 g，葡萄糖10 g，酒石酸銨0.5 g，鞣酸0.5 g，瓊脂20 g，加自來水至1 000 mL.

苯胺藍(lán)變色培養(yǎng)基：苯胺藍(lán)0.1 g，其他成分同鞣酸變色培養(yǎng)基.

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯土豆浸出液200 g，葡萄糖10 g，蛋白胨2 g，酒石酸銨0.2 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g， CaCl20.1 g，維生素B11 mg，加自來水至1 000 mL.

緩沖液：將4.5 g丁二酸加入800 mL蒸餾水中，用NaOH溶液調(diào)其pH至4.5，用蒸餾水定容至1 L.

1.3 菌種的分離和純化

將采集的帶有目標(biāo)菌種的樹枝，樹皮首先切成小段或小塊，然后在蒸餾水中漂洗2～3次，然后用無菌的濾紙擦干.將基礎(chǔ)培養(yǎng)基于121 ℃滅菌鍋中滅菌20 min，然后在超凈工作臺中酒精燈火焰旁倒平板，待基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷凝后，將樹枝或樹皮接種到培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基接種2～3塊.接種后的平板至于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4天，然后用接種環(huán)挑取白色的絨狀或絮狀的菌絲在分離純化培養(yǎng)基倒成的平板上反復(fù)劃線培養(yǎng)，直至獲得純菌株.

1.4 菌種的初篩和復(fù)篩

將獲得的純菌株接種到初篩培養(yǎng)基倒成的平板上，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌絲的生長情況和培養(yǎng)基變色的情況.培養(yǎng)一段時間后挑選出變色圈在菌絲圈之外形成的且產(chǎn)生橙紅色變色圈較明顯的菌株，將其接種到復(fù)篩培養(yǎng)基，同樣置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察培養(yǎng)基的變色情況.

1.5 菌種的保藏

在復(fù)篩培養(yǎng)基中挑選變色反應(yīng)明顯的菌株將其接種到保藏培養(yǎng)基的斜面試管中，并置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3天，然后放到4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆?

1.6 菌種液體培養(yǎng)及漆酶酶活的測定

取50 mL的液體培養(yǎng)基裝到250 mL的錐形瓶中，然后放到滅菌鍋中，121 ℃滅菌20 min，冷卻后接種經(jīng)活化培養(yǎng)6 d的直徑1 cm的菌塊3～4塊，并用紗布塞住瓶口，再用報(bào)紙包住，用繩子綁扎好，以免染菌.再將其放到恒溫振蕩器中培養(yǎng).

1.7 漆酶酶活的測定

粗酶液的制備：菌種自在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的第三天起，取適量的液體培養(yǎng)基，4 000 r·min-1在離心機(jī)中離心10 min，取上清液進(jìn)行漆酶酶活的測定.

漆酶酶活的測定[5]：取0.5 mmol·L-1的愈創(chuàng)木酚溶液(用pH為4.5的緩沖溶液配制)2 mL于試管中，加入1 mL粗酶液，混合均勻后于30 ℃水浴反應(yīng)30 min，測OD465在5 min內(nèi)的變化值.對照管中加2 mL上述緩沖液和1 mL酶液.1個酶活力單位(U)是指每分鐘氧化1μmoL的底物所需的酶量.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的分離和初篩

菌株的初始培養(yǎng)采用營養(yǎng)豐富的PDA綜合培養(yǎng)基，菌絲容易在這種平板上生長擴(kuò)增，培養(yǎng)7～8 d后菌絲就能布滿整個平板.菌種的分離培養(yǎng)基中含有的0.1%濃度的鄰苯基苯酚，可以有效地抑制樹枝和樹皮中的霉菌的生長，使其在培養(yǎng)基中僅可能形成有限的菌落.菌種經(jīng)過在分離培養(yǎng)基的幾次純化就可以獲得純菌株.初篩的目的是獲取能夠降解木質(zhì)素的菌株.Nishida等[6]通過研究認(rèn)為，如果某種微生物能使愈創(chuàng)木酚的平板產(chǎn)生變色反應(yīng)，則這種微生物具有降解木質(zhì)素的能力.然而這種變色反應(yīng)一般有兩種情況，一種是變色圈在菌絲圈的外圈形成，另一種是變色圈在菌絲圈的內(nèi)圈形成，當(dāng)變色圈在菌絲圈的外圈形成時，該菌株能夠降解木質(zhì)素，反之則優(yōu)先降解纖維素[7].根據(jù)這一結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)在產(chǎn)生變色反應(yīng)的平板中挑選變色圈在菌絲圈外圈形成的菌株.

圖1 愈創(chuàng)木酚平板變色反應(yīng)

由圖1所示，本實(shí)驗(yàn)條件下，挑選的這些菌株變色圈直徑均大于菌絲圈，而且變色圈無一例外是在菌絲圈顏色較深呈紅色，在菌絲外圈顏色較淺，呈橙色.

2.2 菌種的復(fù)篩

通過菌種的復(fù)篩，可以得到產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株.鞣酸能利用木質(zhì)素降解菌株產(chǎn)生的漆酶使酚類化合物聚合，從而在菌落周圍形成棕褐色的氧化帶，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)[8].根據(jù)變色圈直徑的大小和產(chǎn)生的時間先后可以判定菌株產(chǎn)漆酶能力的強(qiáng)弱.染料苯胺藍(lán)平板是利用木質(zhì)素降解菌株產(chǎn)生的木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶對苯胺藍(lán)的脫色反應(yīng)來反映這兩種酶的產(chǎn)生.根據(jù)平板上菌落周圍脫色圈的大小和脫色速度的快慢可以衡量菌株產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶的能力[9].

圖2 鞣酸平板變色反應(yīng)

從圖2可以看出，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過復(fù)篩的菌株培養(yǎng)5～6 d后鞣酸平板即產(chǎn)生了較明顯的變色反應(yīng)，變色圈直徑較大且顏色極為明顯，說明該菌株有較強(qiáng)的產(chǎn)漆酶能力.苯胺藍(lán)平板在菌株培養(yǎng)過程中菌落周圍未見明顯的脫色反應(yīng).由于白腐菌對木質(zhì)素的降解是依靠自身產(chǎn)生的多種胞外酶的作用，所以一般白腐菌不會單一的只產(chǎn)一種胞外酶.原因可能是采用的培養(yǎng)基底物的種類、性質(zhì)、濃度等不利于該菌株產(chǎn)過氧化物酶，導(dǎo)致其產(chǎn)過氧化物酶效率很低；也有可能是菌株本身產(chǎn)過氧化物酶能力很弱，所以苯胺藍(lán)平板上未見脫色的陽性反應(yīng).

2.3 菌絲的形態(tài)觀察

從顯色反應(yīng)明顯的鞣酸平板上取少量菌絲，用0.1%的亞甲基藍(lán)染色之后用普通的光學(xué)顯微鏡觀察.從圖3可以看出，菌絲透明，無分支，菌絲內(nèi)有多個細(xì)胞核，有節(jié)狀隔膜，但數(shù)量較少，無鎖狀聯(lián)合，菌絲間有大量的厚垣孢子出現(xiàn).因此，由菌絲的上述特征，可以初步確認(rèn)，篩選獲得的菌株為白腐菌.

圖3 菌絲的形態(tài)觀察

2.4 產(chǎn)漆酶液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)方式的影響

白腐菌是嚴(yán)格好氧的微生物，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的培養(yǎng)主要是通過錐形瓶口的棉塞與外界環(huán)境進(jìn)行氣體交換和氧氣的補(bǔ)充.白腐菌的液體培養(yǎng)分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng).據(jù)報(bào)道[10]大多數(shù)白腐菌在振蕩培養(yǎng)時對產(chǎn)漆酶有利，部分白腐菌在靜止培養(yǎng)時有利于漆酶的產(chǎn)生.本實(shí)驗(yàn)中，自篩的白腐菌在靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)條件下產(chǎn)酶能力差別很大，結(jié)果如圖4所示.

圖4 培養(yǎng)方式對產(chǎn)漆酶的影響

從圖4中可以看出，在靜止培養(yǎng)時，白腐菌在培養(yǎng)的第13天達(dá)到產(chǎn)漆酶的高峰，酶活達(dá)到32 U·mL-1.振蕩培養(yǎng)時.在培養(yǎng)的第11 d即達(dá)到酶活的高峰，酶活高達(dá)67 U·mL-1.靜止培養(yǎng)時菌絲相互交織成網(wǎng)，最后形成了幾乎布滿錐形瓶底的菌絲墊.菌絲墊上層的菌絲可以在培養(yǎng)基和錐形瓶內(nèi)空氣的界面獲得充足的氧氣，而大部分下層的菌絲由于氧氣向菌墊內(nèi)部傳遞相對比較困難，所以下層的菌絲不能獲得充足的氧氣來利用培養(yǎng)基中的碳源和氮源進(jìn)行生長代謝，所以進(jìn)入次生代謝的階段較慢.振蕩培養(yǎng)條件下菌絲纏繞成團(tuán)，形成白色小球.小球和液體培養(yǎng)基的接觸面積相對菌墊來說較大，另外小球在錐形瓶內(nèi)不停的運(yùn)動，這樣氧氣在菌絲中有很好的傳遞和傳質(zhì)效果，因此小球在生長代謝過程中有充足的氧氣利用，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)被利用的較充分，所以進(jìn)入次生代謝的階段不但快，而且由于營養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗，次生代謝的條件較理想，因此達(dá)到酶活高峰的時間短而且酶活較高.

2.4.2 溫度的影響

白腐菌的生長和擴(kuò)增所需的溫度范圍一般在28～39 ℃，實(shí)際上對溫度的限制并不十分嚴(yán)格[3].從圖5也可以看出，不同的培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)漆酶的影響并不十分顯著，但28～35 ℃是比較合適的溫度范圍，在這個溫度范圍，白腐菌在11天達(dá)到漆酶酶活的高峰，比其他溫度下培養(yǎng)達(dá)到酶活高峰要早1～2 d，因此28～35 ℃可以作為白腐菌培養(yǎng)的最佳溫度范圍.

圖5 溫度對產(chǎn)漆酶的影響

2.4.3 轉(zhuǎn)速的影響

在300 mL的錐形瓶中加入50 mL的液體培養(yǎng)基，接種白腐菌后，置于28 ℃的恒溫振蕩器中培養(yǎng).從培養(yǎng)的第四天開始測漆酶的酶活.從圖6可以看出，當(dāng)恒溫振蕩器轉(zhuǎn)速為140 r·min-1菌的漆酶酶活達(dá)到最大值.轉(zhuǎn)速過大或過小都不利于白腐菌對漆酶的合成和分泌.原因是白腐菌是嚴(yán)格好氧的微生物，它的生長和代謝活動需要充足的氧氣供應(yīng)，較高的轉(zhuǎn)速雖然能增大氧氣在培養(yǎng)基中的傳質(zhì)效果，但是白腐菌產(chǎn)的漆酶是一種胞外酶，這種胞外酶對機(jī)械剪切力特別敏感，過高的機(jī)械剪切力容易造成漆酶結(jié)構(gòu)的破壞和酶活性的喪失.

圖6 恒溫振蕩器轉(zhuǎn)速對產(chǎn)漆酶的影響

2.4.4 初始pH的影響

漆酶的合成和表達(dá)受環(huán)境pH的影響比較顯著，因此培養(yǎng)基初始的pH直接影響白腐菌生長和產(chǎn)酶的代謝活動.由圖7可知，當(dāng)液體培養(yǎng)基初始pH為5時，白腐菌的產(chǎn)漆酶的活性最高，高于或低于5，白腐菌產(chǎn)漆酶的活性均受到不同程度的影響，尤其是低于5時，白腐菌不但生長擴(kuò)增速度較慢，而且產(chǎn)酶活性較低.

圖7 初始pH對產(chǎn)漆酶的影響

2.4.5 CuSO4加入量的影響

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，它的結(jié)構(gòu)中有四個銅原子[11].Cu2+的加入對漆酶合成和活性有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，其中CuSO4是使用最多的，誘導(dǎo)效果最好的重金屬誘導(dǎo)劑[12].

圖8 Cu2+濃度對產(chǎn)漆酶的影響

從圖8可以看出，隨著CuSO4濃度的增加白腐菌分泌漆酶的活性也隨之升高，在0.5 mmol·L-1時達(dá)到最高，約是無Cu時的3倍，所以此CuSO4濃度下對白腐菌產(chǎn)漆酶的誘導(dǎo)效果最好，這是由于Cu2+不但促進(jìn)了漆酶的合成，同時也增強(qiáng)了漆酶這種胞外酶在細(xì)胞外環(huán)境中的穩(wěn)定性.

3 結(jié)束語

(1)通過對野外采集的菌種進(jìn)行初始培養(yǎng)，分離純化后獲得純菌株.將純菌株在初篩的愈創(chuàng)木酚平板中培養(yǎng)，挑選出變色反應(yīng)明顯，且變色圈大于菌絲圈的菌株.對初篩獲得的菌株經(jīng)過復(fù)篩，得到產(chǎn)漆酶能力較強(qiáng)的菌株.通過對菌絲形態(tài)的顯微鏡觀察，可以初步認(rèn)為篩選得到的菌株為白腐菌.

(2)對菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，振蕩培養(yǎng)對菌株產(chǎn)漆酶要優(yōu)于靜止培養(yǎng)，當(dāng)溫度為28～35 ℃，轉(zhuǎn)速為140 r·min-1，培養(yǎng)基礎(chǔ)初始pH為5，誘導(dǎo)劑CuSO4加入量為0.5 mmol·L-1最有利于菌株產(chǎn)漆酶，可以作為液體培養(yǎng)的最佳條件.

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