紅毛七中三萜皂苷類化學(xué)成分生物活性研究

楊秀芳, 馬養(yǎng)民， 邢 華， 劉建軍， 康永祥

(1.陜西科技大學(xué) 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

0 引言

紅毛七(CaulophyllumrobustumMaxim.)為小檗科紅毛七屬植物，主產(chǎn)于我國的東北地區(qū)、甘肅、陜西、四川 等地[1].其根及根莖是藥用部位，可以栽培，紅毛七具有很強(qiáng)的活血化瘀，祛風(fēng)通絡(luò)等作用[2].在民間可以用來治療風(fēng)濕疼痛、類風(fēng)濕、胃腹疼痛、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)、關(guān)節(jié)炎等病[3].

為進(jìn)一步明確紅毛七藥理活性與其化學(xué)成分的構(gòu)效關(guān)系，本文對(duì)陜西太白山產(chǎn)紅毛七中分離得到的化合物抑菌活性、鎮(zhèn)痛活性和抗炎活性等進(jìn)行研究，期望從中獲得生物活性比較好的化合物，為開發(fā)利用紅毛七提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

以采自陜西太白山紅毛七分離純化得到的α-菠菜甾醇、16α-羥基-齊墩果-12-烯-28-酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、葳嚴(yán)仙皂苷元-3-O-α-LV阿拉伯吡喃糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-D-V葡萄吡喃糖- (1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷[4]為測(cè)試樣品.

1.1.2 供試菌種

細(xì)菌:金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、乳鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)

植物病原真菌：小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides).

1.1.3 動(dòng)物

雄性昆明種小鼠，18～22 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供(合格證號(hào)：SCXK(軍)2007-007).

1.1.4 儀器

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)、YX280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋、101-1型干燥箱、DH5000B電熱恒溫培養(yǎng)箱、HZQ-Q全溫振蕩器、血球計(jì)數(shù)板、BS224S分析天平.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)試液的配制

將分離得到化合物1、2、3、4、5等五個(gè)純品化合物，分別用二甲基亞砜(DMSO)配成1.0 mg/mL，滅菌后置入超凈工作臺(tái)中備用.

1.2.2 菌液制備

將在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的大腸桿菌(E.c)、乳鏈球菌(S.t)、金黃色葡萄球菌(S.a)、枯草芽孢桿菌(B.s)、小麥赤霉病菌(F.g)、白菜黑斑病菌(A.b.)、西瓜枯萎病菌(F.o.n)、葡萄炭疽病菌(C.g)從恒溫培養(yǎng)箱中取出，在殺菌后的超凈工作臺(tái)上將以上各菌接種至配制好的液體培養(yǎng)基中，再將接菌后的液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至全溫振蕩器，溫度恒定在28 ℃培養(yǎng)48 h，備用[5].

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

(1)取紫外消毒的96孔板，豎排依次編號(hào)A、B、C、D、E、F、G，橫排依次編號(hào)1、2、3、4、5、6、7、8(編號(hào)為A1、 A2、 A3、 A4、 A5、 A6、 A7、A8，B1-B8……F1-F8，G1-G8).選取一種稀釋過的菌懸液，在殺菌后的超凈工作臺(tái)上，用移液槍吸取100μL菌懸液放置在板孔中，重復(fù)此操作，在編號(hào)的孔板注入100μL菌懸液.

(2)在殺菌后的超凈工作臺(tái)上，將按1.2.1章節(jié)所述方法配制好的α-菠菜甾醇樣品，用移液槍吸取100μL注入在已有菌懸液的A1孔中、混勻.待菌懸液與α-菠菜甾醇樣品混勻后，再用移液槍從A1孔中吸取混合液體100μL，注入A2孔中，依次進(jìn)行倍半稀釋，將A1-A8孔分別注入.最后，從A8孔中吸取出100μL混合溶液，棄掉.經(jīng)過此步操作，A1-A8孔中均剩余100μL混合溶液，α-菠菜甾醇樣品濃度依次為500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.3μg/mL，15.6μg/mL，7.8μg/mL，3.9μg/mL.

(3)按照步驟(2)的操作，將B1-B8注入16α-羥基-齊墩果-12-烯-28-酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷，C1-C8注入常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷，D1-D8注入葳嚴(yán)仙皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷，E1-E8注入常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖- (1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷，F(xiàn)1-F8注入對(duì)照樣品，細(xì)菌以硫酸卡那霉素(CK1)和青霉素鈉(CK2)作為陽性對(duì)照，真菌以酮康唑(CK3)作為陽性對(duì)照，G1-G8為空白對(duì)照.

(4)再取96孔板，按照步驟(1)至(3)把各個(gè)測(cè)試菌與各個(gè)測(cè)試樣品混合，完成后，將注入待測(cè)樣品與菌懸液的96孔板放入電熱恒溫培養(yǎng)箱中，溫度恒定在28 ℃培養(yǎng)24 h.用酶標(biāo)儀測(cè)各個(gè)板孔的透光度，再由透光度來計(jì)算各個(gè)樣品的抑制率[6].

式中：P-抑制率，K0-溶劑對(duì)照孔，K1-樣品孔 ，K2-空白對(duì)照孔.

1.2.4 鎮(zhèn)痛活性測(cè)定

取雄性昆明小鼠48只，隨機(jī)分成8組，每組6只.采用熱板法進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性試驗(yàn)，其中一組皮下注射生理鹽水，作為空白對(duì)照；一組皮下注射30 mg/kg阿司匹林(Aspirin)水溶液，作為對(duì)照組；其余6組編號(hào)為常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷a、b、c、d、e、f，分別皮下注射不同濃度的化合物3試液(給藥量為100、50、30、10、3、1 mg/kg)，每只小鼠注射量為0.2 mL.

將注射藥品后的小鼠尾巴置于(50±0.5)℃恒溫水浴鍋中，記錄小鼠從尾巴放入水浴鍋中到第一次甩尾所用的時(shí)間(T)，每隔15 min將小鼠尾巴放入水浴鍋測(cè)一次，即測(cè)量小鼠給藥0 min、15 min、30 min、45 min、60 min后的甩尾時(shí)間[7].將小鼠未給藥前的甩尾時(shí)間設(shè)為T0，鎮(zhèn)痛率公式如下

式中：P-痛閾提高率，T-給藥后小鼠甩尾時(shí)間，T0-給藥前小鼠甩尾時(shí)間.

再以常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷為測(cè)試液，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn).

1.2.5 抗炎活性測(cè)定

采用抑制二甲苯致小鼠耳腫脹法.雄性昆明小鼠36只，隨機(jī)分為6組，每組6只.測(cè)試組分別為不同濃度的常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(給藥量為1、3、10、30 mg/kg)；阿司匹林30 mg/kg劑量組為對(duì)照組；以生理鹽水為空白組.

以上各組分別按0.2 mL/10 g皮下注射藥物及對(duì)照液，每天一次，連續(xù)5天.末次給藥后1 h，以30μl二甲苯涂予小鼠右耳兩面致炎，左耳不涂，致炎后45 min處死小鼠.用直徑9 mm的打孔器打下左右耳片，稱重，以左右耳片重量差作為腫脹程度[8].數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗(yàn).取腫脹平均值計(jì)算抑制率，其公式如下.

抑制率Y(%)=(E0-Et)/E0×100%

其中：E0、Et分別代表空白組和給藥組的平均腫脹度.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物抑菌活性

從紅毛七中分離純化得到的常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(1)、常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(2)、16α-羥基-齊墩果-12-烯-28-酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(3)、葳嚴(yán)仙皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(4)、α-菠菜甾醇(5)等的MIC測(cè)試結(jié)果(見表1)可以看出，5個(gè)化合物對(duì)測(cè)試的8種菌均有一定的抑制作用.

表1為各樣品對(duì)測(cè)試細(xì)菌的MIC，表2為各樣品對(duì)植物病原真菌的MIC.從表中看出：化合物1-4抑制植物病原真菌的能力明顯大于化合物5，說明具有齊墩果烷型的三萜皂苷比甾醇類化合物有更好的抑制真菌能力.化合物3和4抑菌活性大于化合物1和2；MIC數(shù)據(jù)顯示，同等條件下與真菌相比，5個(gè)化合物對(duì)細(xì)菌有更為顯著的抑制作用，其中化合物3和4具有廣譜抑菌活性，可以作很好的抗菌劑使用.

表1 不同化合物對(duì)細(xì)菌最小抑菌濃度

表2 不同化合物對(duì)真菌最小抑菌濃度

2.2 化合物鎮(zhèn)痛活性

通過熱板法，按照章節(jié)1.2.4中所述，測(cè)試不同濃度常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(1)，常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(2)等對(duì)小鼠痛閾值提高率隨時(shí)間的變化，研究化合物1、2的鎮(zhèn)痛活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1、2.

圖1 不同劑量的化合物1對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛提高率隨時(shí)間變化的趨勢(shì)

圖2 不同劑量的化合物2對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛提高率隨時(shí)間變化的趨勢(shì)

從圖1、2看出，2種化合物對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛提高率與劑量呈依賴性，在濃度為1～30 mg/kg范圍內(nèi)，鎮(zhèn)痛效果隨劑量的增大而增大；濃度為30～100 mg/kg范圍內(nèi)，鎮(zhèn)痛效果隨劑量的增大而減小；隨時(shí)間的變化趨勢(shì)是鎮(zhèn)痛提高率先增大后減小，注射化合物30 min后達(dá)最大.

2種化合物等劑量時(shí)鎮(zhèn)痛效果的比較，結(jié)果見圖3.結(jié)果顯示：等劑量的化合物1，2對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛效果均大于對(duì)照組阿司匹林，化合物2更為顯著，甚至濃度為10 mg/kg時(shí)鎮(zhèn)痛效果比濃度為30 mg/kg阿司匹林還顯著.從結(jié)構(gòu)上來看，帶有雙糖的化合物2比帶有單糖的化合物1鎮(zhèn)痛效果更顯著.

圖3 等劑量的化合物1，2與阿司匹林對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛提高率隨時(shí)間的變化趨勢(shì)

2.3 化合物抗炎活性

通過抑制二甲苯致小鼠耳腫脹法，按照章節(jié)1.2.5中所述，測(cè)試不同濃度常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(1)，常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(2)等致小鼠耳腫脹程度隨時(shí)間的變化，通過抑制率研究化合物1、2抗炎活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3.

表3 化合物1、2與阿司匹林致小鼠耳腫脹抑制率

從表3看出，化合物1、2均有抗炎作用，且抗炎效果與化合物的濃度成劑量依賴性，當(dāng)濃度同為30 mg/kg時(shí)，2種化合物抑制率均大于阿司匹林，抗炎效果較為顯著.從結(jié)構(gòu)上看，化合物1、2母核結(jié)構(gòu)相同，連接糖的個(gè)數(shù)不同，化合物1為單糖皂苷，化合物2為雙糖皂苷，化合物1的抗炎效果大于化合物2.

3 結(jié)論

(1)紅毛七中含有豐富的具有抑菌活性的物質(zhì).其中三萜皂苷類化合物對(duì)細(xì)菌具有更為顯著的抑制作用.

(2)三萜皂苷類化合物對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛提高率與劑量呈依賴性，同種劑量的化合物相比，含有雙糖的化合物鎮(zhèn)痛效果更好.

(3)從紅毛七中分離得到三萜皂苷類化合物具有抗炎作用，抗炎效果與化合物的濃度成劑量依賴性.且含有單糖的化合物的抗炎效果大于含有雙糖的化合物.推測(cè)抗炎效果與皂苷元上連接糖的個(gè)數(shù)有關(guān).

[1] 黃泰康,丁志遵,趙守訓(xùn).現(xiàn)代本草綱目[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2000:2 049-2 052.

[2] 宋小妹，劉海靜.太白七式研究與應(yīng)用[M].北京：人民出版社，2011：152-157.

[3] 宋小妹，唐志書.中藥化學(xué)成分提取分離與制備[M].北京：人民出版社，2004：242-243.

[4] 馬養(yǎng)民，邢 華，劉建軍，等.太白七藥紅毛七化學(xué)成分研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(2):745-747.

[5] 趙 斌, 何紹江.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:科學(xué)出版社, 2002:72-252.

[6] 臧紅新，延慧君，段姚堯，等.青橄欖葉提取物體外抑菌活性研究[J]．武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011， 20(12)：935-937．

[7] 楊 蘋，熊 嫻，楊紅要，等.HMT抗炎、鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)研究[J].華夏醫(yī)學(xué), 2006，19(6)：1 060-1 062.

[8] 信紅嶺，閉 娟，劉 淼，等.奇任醇的抗炎免疫實(shí)驗(yàn)研究[J].中草藥，2005,36(6):866-870.