基于殼聚糖的納米材料在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展

李曉靜 王新木 董 研* 茍中入

1(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔修復(fù)科，杭州 310009)

2(杭州市第一人民醫(yī)院口腔科，杭州 310006)

3(浙江大學(xué)浙江加州國際納米技術(shù)研究院，杭州 310029)

引言

骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)，是指體外構(gòu)建人工骨組織或者利用生物裝置、植入生物材料來刺激骨原細(xì)胞或干細(xì)胞分化，維持和促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，以重建缺損的骨組織。骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)依賴于多個因素，主要包括細(xì)胞、生長因子、生物支架和穩(wěn)定的機(jī)械環(huán)境［1］。自體骨和同種異體骨移植可滿足以上要求，但兩者均存在不足之處:自體骨骨量極為有限，并且增加了手術(shù)部位和傷口愈合期并發(fā)癥［2］;同種異體骨移植可能引發(fā)慢性炎癥，甚至產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。因此，骨移植修復(fù)術(shù)的不足促進(jìn)了人工骨修復(fù)生物材料的發(fā)展。譬如，已對羥基磷灰石 (HA)、A-W玻璃陶瓷、殼聚糖、膠原以及復(fù)合材料等已在骨損傷修復(fù)中的應(yīng)用開展了廣泛研究［3－4］。

甲殼素，又名甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)，化學(xué)名稱為聚N-乙酰葡萄糖胺，主要存在于甲殼類動物蝦、蟹、昆蟲的外殼及高等植物的細(xì)胞壁中，是世界上第二豐富的天然生物聚合物［5－6］。殼聚糖是甲殼素脫乙?；难苌?，又名幾丁糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性。大量研究已證實，殼聚糖還具有抗菌［7］、止血、促進(jìn)傷口愈合［8］、促進(jìn)骨再生［9］等優(yōu)良的生物學(xué)效應(yīng)，也可與膠原、HA、二氧化硅等復(fù)合制備成為薄膜、海綿、可注射型水凝膠形式，應(yīng)用于骨組織修復(fù)領(lǐng)域［10－11］。

但是，采用常規(guī)方法制備的殼聚糖多孔支架的不足之處在于材料的綜合力學(xué)性能差，對成骨細(xì)胞生長刺激效應(yīng)以及促進(jìn)成骨細(xì)胞分化相關(guān)生長因子表達(dá)的效應(yīng)低［12］。為了彌補(bǔ)這些缺陷，納米材料逐漸應(yīng)用于骨損傷修復(fù)領(lǐng)域。納米材料指某一維度具有1～100 nm尺寸的材料，具有高表面積體積比，在骨損傷修復(fù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景［13］?；谀壳皻ぞ厶羌{米材料在骨損傷修復(fù)中的廣泛研究及取得的相關(guān)成果，下面就殼聚糖以及所涉及的納米纖維支架、納米粒子和納米復(fù)合支架材料的制備方法以及在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)行綜述。

1 基于殼聚糖的納米材料的制備方法

1.1 殼聚糖納米纖維

殼聚糖納米纖維的制備方法包括靜電紡絲法［14］、自組裝法［15］和熱誘導(dǎo)相分離法［16］等，其中靜電紡絲法的應(yīng)用較多。靜電紡絲法的基本原理是:帶電的聚合物溶液或熔體在外加高壓靜電場力作用下形成噴射流，經(jīng)溶劑蒸發(fā)或熔體冷卻干燥后形成納米纖維。影響電紡射流穩(wěn)定性和納米纖維形態(tài)的因素較多，主要包括聚合物的性質(zhì)(如溶液濃度、黏度、表面張力、導(dǎo)電性等)、操作參數(shù)(如電壓、接收距離、溶液推射速度)以及外部環(huán)境(如溫度、濕度等)［17］。

靜電紡絲技術(shù)制備的殼聚糖纖維直徑通常在數(shù)十納米至數(shù)微米之間，無規(guī)則沉積后形成無紡布狀的纖維膜，其顯著特征是納米纖維支架具有極高的表面積體積比和高的孔隙率，形態(tài)類似于天然細(xì)胞外基質(zhì)的纖維結(jié)構(gòu)［18］。但靜電紡絲技術(shù)制備的膜通常是二維(2D)的納米纖維膜，其高孔隙率利于蛋白吸收及細(xì)胞黏附，但其孔徑較小，使得細(xì)胞只能在其表面生長而不能伸入其內(nèi)部。為了得到大孔徑的三維(3D)支架，有學(xué)者采用NaCl作為致孔劑，使納米纖維膜的孔徑及孔隙率均有所提高［19］，或采用改變接收裝置法［20］、超聲法［21］與其他支架復(fù)合［22］等方法。

自組裝方法制備的納米纖維較細(xì)小，直徑平均200 nm，長度僅為幾微米。納米纖維直徑受殼聚糖分子量、殼聚糖濃度、溶液pH和溫度等影響［23］。

1.2 殼聚糖納米粒子

殼聚糖納米粒子的制備方法有離子交聯(lián)法、聚電解質(zhì)復(fù)合法、乳化交聯(lián)法、乳化液滴聚集法、乳化溶劑擴(kuò)散法、反向微乳法等［24］。離子交聯(lián)法中最常使用的離子交聯(lián)劑是三聚磷酸鈉 (TPP)，多用作藥物緩釋載體的制備，由于其反應(yīng)條件簡單溫和，成為目前殼聚糖納米粒子制備研究中最常使用的方法。在制備體系中，殼聚糖分子量及濃度、殼聚糖/TPP質(zhì)量比以及溶液的pH值等均會影響納米粒的粒徑及表面電荷。聚電解質(zhì)復(fù)合法的反應(yīng)原理同離子交聯(lián)法的反應(yīng)原理，殼聚糖與大分子聚陰離子(如羧甲基羥乙基纖維素、肝素、胰島素和DNA等)可聚合為納米粒子，作為生物大分子的運(yùn)輸載體。

乳化交聯(lián)法、乳化液滴聚集法、乳化溶劑擴(kuò)散法、反向微乳法等通常在有機(jī)溶劑體系中使用，或制備程序繁瑣，所以用其制備納米顆粒作為生物材料受到一定限制［25］。

1.3 殼聚糖納米復(fù)合材料

磷酸鈣是一類包括天然骨組織細(xì)胞外無機(jī)礦物基質(zhì)主要成分在內(nèi)的無機(jī)化合物，其最穩(wěn)定的一種形式是HA，骨骼中的無機(jī)礦物為碳酸化羥基磷灰石(CHA)。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，不少磷酸鈣均可作為骨移植材料植入骨缺損區(qū)，逐漸被新形成的骨組織所取代，具有良好的骨引導(dǎo)性。碳納米管 (CNTs)是碳的同素異形體，呈圓柱形納米結(jié)構(gòu)，長度與直徑比可達(dá)28000000∶1，結(jié)構(gòu)與化學(xué)性能穩(wěn)定，其最顯著的特征是具有較高的機(jī)械性能。已有研究證明，將納米羥基磷灰石 (nHA)、納米磷酸鈣、CNTs與殼聚糖基質(zhì)混合后，采用冷凍干燥、原位合成、沉淀法等方法，可制備成多孔的殼聚糖復(fù)合納米材料支架［2］。另外，人們也發(fā)現(xiàn)，nHA、CaO-P2O5-SiO2組成的生物活性無機(jī)納米粒子等與殼聚糖基質(zhì)混合，逐滴加入甘油磷酸酯二鈉鹽(GP)，持續(xù)攪拌后可制備成熱塑型的可注射型復(fù)合凝膠［26－27］，由于其具有微創(chuàng)可注射特性，因而在骨損傷修復(fù)中備受關(guān)注。

2 在骨組織工程及再生醫(yī)學(xué)中的研究

2.1 作為骨組織工程生物支架

在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)中，生物支架的性能至關(guān)重要。良好的生物相容性、可降解性、高孔隙率、具有一定的機(jī)械穩(wěn)定性和骨引導(dǎo)性等，是骨組織工程中生物支架所應(yīng)滿足的基本要求［28］。殼聚糖生物支架具有極好的生物相容性，在體內(nèi)可被溶菌酶等降解為無毒的低聚糖，被人體吸收利用;生物支架具有大孔徑及高的孔隙率，可引導(dǎo)組織中的細(xì)胞在其表面及支架內(nèi)部黏附生長增殖，并利于血管形成及骨基質(zhì)礦化物的形成。但其機(jī)械強(qiáng)度相對較低，本身不具有骨誘導(dǎo)性，對細(xì)胞生物活性較低。隨著材料科學(xué)和生命科學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)納米纖維支架和納米復(fù)合生物支架可以克服這些缺點。

2.1.1 殼聚糖納米纖維支架

Shin等采用靜電紡絲法制備了殼聚糖納米纖維膜，纖維直徑平均200 nm，孔徑大小平均5 μm，孔隙率80%，抗張強(qiáng)度達(dá)10 MPa［29］，高于目前臨床常用的引導(dǎo)骨再生膜Bio-Gide的抗張強(qiáng)度(約2.94 MPa)［30］。但也有學(xué)者的研究結(jié)果顯示，殼聚糖納米纖維膜的機(jī)械強(qiáng)度較低，殼聚糖含量為50%的殼聚糖膠原納米纖維膜抗張強(qiáng)度僅為1.5 MPa，且隨著殼聚糖含量增加，纖維膜的抗張強(qiáng)度降低［31］。剪切強(qiáng)度測試表明，交聯(lián)與未交聯(lián)的殼聚糖納米纖維膜均低于臨床常用的引導(dǎo)骨再生Bio-Mend膜［32］?？梢?，殼聚糖納米纖維膜的機(jī)械強(qiáng)度還亟待提高。

Datta等在N-亞甲基磷酸殼聚糖 (NMPC)納米纖維膜與NMPC凝膠支架上植入成骨樣細(xì)胞，第5 d時經(jīng)細(xì)胞染色熒光顯微鏡觀察:納米纖維膜上的細(xì)胞呈多角形，鋪展于支架表面，而凝膠支架上的細(xì)胞呈簇狀分布，且納米纖維膜上的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的增殖率及功能活性［33］。由于納米纖維支架可模擬細(xì)胞外基質(zhì)膠原纖維，比表面積較大，利于細(xì)胞的偽足在材料表面黏附，可促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)一步在支架表面生長增殖。

Zhao等將聚丙烯碳酸酯/殼聚糖納米纖維支架(PPC/CSNFs)、聚丙烯碳酸酯支架 (PPC)植入到兔股骨髁突直徑為6 mm、長為10 mm的骨缺損處，16周組織學(xué)觀察到:植入PPC/CSNFs支架組的缺損邊界消失，骨缺損區(qū)已完全被新生骨組織所取代，且比PPC支架組的新生骨量多，而空白對照組只有少量的再生骨，邊界仍清晰可見［16］。由此表明，殼聚糖納米纖維支架具有高表面體積比，利于組織中細(xì)胞的黏附及生長增殖，從而加速了骨再生修復(fù)。

2.1.2 殼聚糖納米復(fù)合材料支架

已有研究發(fā)現(xiàn)，納米磷酸鈣、nHA或CNTs與殼聚糖基質(zhì)混合制備的納米復(fù)合支架具有較高的機(jī)械性能，且隨著納米材料含量的增加，機(jī)械性能提高［34－36］，而且三者良好的骨引導(dǎo)性利于成骨細(xì)胞在支架表面及內(nèi)部的生長增殖。將成骨樣細(xì)胞植入到功能性多壁碳納米管/殼聚糖復(fù)合支架上體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以大量黏附、增殖并向成骨細(xì)胞分化［37］。將nHA/殼聚糖海綿樣三維支架植入到大鼠顱頂骨直徑為6.5 mm的圓形骨缺損中，組織學(xué)觀察，在2周時骨缺損區(qū)邊緣及支架中心有新骨形成，在5周時植入支架的骨缺損區(qū)與空白對照相比已有明顯的新骨形成［38］。

由CaO-P2O5-SiO2三元氧化物組成的生物活性玻璃無機(jī)納米粒子及二氧化硅和氧化鋯納米粒子均可與殼聚糖基質(zhì)混合制備成納米復(fù)合凝膠或支架，復(fù)合材料在浸入與人體血漿離子濃度相似的模擬體液中14天后，掃描電鏡觀察到復(fù)合支架表面或孔內(nèi)均有致密的磷灰石晶體形成［27，39］。這說明，復(fù)合支架表面納米粒子及降解時游離出的無機(jī)納米粒子可促進(jìn)骨樣礦物鹽在支架表面沉積。

2.2 作為生長因子的緩釋載體

生長因子是一類通過與特異的、高親和的細(xì)胞膜受體結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞生長與其他細(xì)胞功能等多效應(yīng)的多肽類物質(zhì)。骨誘導(dǎo)性生長因子包括骨形態(tài)形成蛋白 (BMP)、血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF)、血小板源性生長因子等［12］，可在骨修復(fù)過程中促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制破骨細(xì)胞生長，從而誘導(dǎo)骨形成。殼聚糖納米粒子可作為骨誘導(dǎo)性生長因子的釋放載體，當(dāng)植入骨缺損區(qū)后，釋放的生長因子高效調(diào)控成骨細(xì)胞的生長增殖，進(jìn)而提高骨再生效率。

有學(xué)者采用離子交聯(lián)法制備了包載BMP-2的殼聚糖微球，平均直徑230 nm，微球分散性好。用殼聚糖微球浸提液來培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞，細(xì)胞生物相容性較好，無細(xì)胞毒性［40］。殼聚糖微球?qū)MP-2的包載率可達(dá)85%，體外研究釋放緩慢，釋放時間可持續(xù)30 d［41］。Hou制備的殼聚糖微球表面呈多孔結(jié)構(gòu)，經(jīng)吸附rhBMP-2后復(fù)合到膠原海綿支架上，在兔橈骨15 mm節(jié)段性骨缺損處植入復(fù)合支架，12周后組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，吸附rhBMP-2的殼聚糖微粒復(fù)合支架組比rhBMP-2/膠原支架組有明顯的骨再生［42］，說明殼聚糖微球是rhBMP-2的有效載體，可保持其生物活性。

VEGF可促進(jìn)血管的再生，利于骨損傷修復(fù)中血管網(wǎng)絡(luò)的建立。有學(xué)者將殼聚糖、硫酸葡聚糖和VEGF共混制備的包載VEGF的納米粒子和游離VEGF分別植入到聚丙交酯－乙交酯(PLGA)支架中，將兩種形式的支架植入鼠腹膜脂肪層，2周后采用免疫染色檢測內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量，采用自體熒光檢測紅細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示包載VEGF納米粒子組內(nèi)皮細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)量比游離VEGF復(fù)合支架組要顯著增多，血管再生明顯［43］，表明殼聚糖納米粒子可作為VEGF的有效載體，在骨損傷修復(fù)中發(fā)揮其促進(jìn)血管再生的作用。

2.3 作為外源基因的遞送載體

殼聚糖帶正電荷氨基可以和帶負(fù)電荷DNA分子通過聚電解質(zhì)復(fù)合法制備成納米粒子，作為外源基因的遞送載體，通過轉(zhuǎn)染到體內(nèi)細(xì)胞經(jīng)基因表達(dá)而發(fā)揮其生物性能，是骨再生醫(yī)學(xué)基因治療中的有效載體［44］。Nie制備了包載BMP-2質(zhì)粒DNA的殼聚糖納米粒子復(fù)合PLGA/HA支架，研究者將復(fù)合支架植入到鼠脛骨的骨缺損處，相比對照組表現(xiàn)出更高且持久的骨愈合能力［45］。實驗表明，殼聚糖納米粒子作為DNA的有效緩釋載體，可維持其轉(zhuǎn)染活性，并發(fā)揮其有效的生物學(xué)活性。

殼聚糖納米粒子對轉(zhuǎn)化生長因子 β1質(zhì)粒(pTGF-β1)包載率可達(dá) (87.5 ±2.3)%，體外釋放實驗結(jié)果顯示，初期時釋放較快，之后釋放緩慢，并隨著時間延長釋放率逐漸增加，在90天時釋放40%左右。殼聚糖/pTGF-β1納米粒與裸pTGF-β1體外轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，在48 h后流式細(xì)胞儀檢測，兩組的轉(zhuǎn)染率分別為(7.18±1.52)%和(0.97±40.70)%，有顯著差異?？梢?，殼聚糖納米?？沙浞职dpTGF-β1，具有良好的緩釋性能，且能成功轉(zhuǎn)染體外細(xì)胞［46］。

有研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖雖能包載DNA和RNA，并能避免核酸被核酸酶降解，但其水溶性小、轉(zhuǎn)染效率較低［46－47］。將殼聚糖化學(xué)改性，在烷基化殼聚糖和巰基殼聚糖包載DNA和RNA后，其轉(zhuǎn)染效率可有所提高。Yu等制備了BMP-4和VEGF121基因的重組質(zhì)粒，經(jīng)巰基烷機(jī)化殼聚糖和重組質(zhì)粒聚電解質(zhì)反應(yīng)制備了納米粒子，復(fù)合明膠海綿后植入到兔橈骨長度15 mm的骨缺損處，結(jié)果顯示實驗組比明膠海綿組骨再生速度快且新生骨量較多［48］。究其原因，可能是改性的殼聚糖納米粒子增強(qiáng)了與細(xì)胞的黏附率、滲透率，使得基因轉(zhuǎn)染率提高。

此外，殼聚糖/聚丙烯酸納米纖維也可作為質(zhì)粒DNA的有效載體，已證實可成功轉(zhuǎn)染人類真皮成纖維細(xì)胞［23］。

3 問題及展望

通過回顧3種基于殼聚糖的納米材料在骨損傷修復(fù)與再生醫(yī)學(xué)中的研究，發(fā)現(xiàn)殼聚糖納米復(fù)合材料可提高殼聚糖支架的機(jī)械強(qiáng)度及對成骨細(xì)胞的生物活性;殼聚糖納米纖維支架在結(jié)構(gòu)、形態(tài)上與天然膠原纖維相似，類似于天然骨細(xì)胞外基質(zhì)，其納米級尺寸、高孔隙率、高表面體積比有利于成骨細(xì)胞黏附增殖及功能分化，同時也可作為生物活性因子的遞送載體;殼聚糖納米粒子是生物活性因子、外源基因等的有效載體，通過包載具有誘導(dǎo)成骨性的生長因子及外源基因，可提高骨再生能力。然而，目前主要是對基于殼聚糖的納米材料的體外及動物體內(nèi)的研究，但有些問題尚需進(jìn)一步研究，如其納米材料的體內(nèi)降解時間是否能滿足骨再生的需求，殼聚糖納米纖維三維支架的制備和其機(jī)械性能的提高，殼聚糖納米粒子對生物因子、基因的包載率、轉(zhuǎn)染率的提高，以及殼聚糖納米材料促進(jìn)前成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞增殖及分化中的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。同時，制備殼聚糖納米材料支架也是未來研究方向之一，這種支架既具有高的機(jī)械性能，結(jié)構(gòu)、形態(tài)類似天然骨細(xì)胞外基質(zhì)，又可作為生物活性因子和外源基因的緩釋載體。

另外，作為天然生物材料，殼聚糖主要從甲殼類動物蝦、蟹、昆蟲的外殼中通過堿處理或酶解脫乙酰化所得，其脫乙酰度(30% ～95%)及分子量(30～1000 kDa)因原材料來源、制備方法及制備條件的不同而變化［2，5］。目前，研究對殼聚糖物理性能的要求僅限于殼聚糖的脫乙酰度及分子量，而對殼聚糖提取的純度、雜蛋白的種類和含量以及安全性標(biāo)準(zhǔn)的研究尚比較缺乏。而且，酸堿化學(xué)處理提取殼聚糖的方法對環(huán)境會造成一定的影響，其制取方法還需進(jìn)一步改善。

總之，殼聚糖納米材料支架和作為緩釋載體的殼聚糖納米粒子在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)的研究中具有廣闊的空間，且有望在骨缺損修復(fù)再生中得以臨床應(yīng)用。

［1］Kessler MW，Grande DA.Tissue engineering and cartilage［J］.Organogenesis，2008，4(1):28－32.

［2］Venkatesan J，Kim SK.Chitosan composites for bone tissue engineering—an overview［J］.Mar Drugs，2010，8(8):2252－2266.

［3］Giannoudis PV，Dinopoulos H，Tsiridis E.Bone substitutes:an update［J］.Injury，2005，36(Suppl 3):S20 －S27.

［4］Swetha M，SahithiK，MoorthiA，etal. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering［J］.Int J Biol Macromol，2010，47(1):1 －4.

［5］Francesko A，Tzanov T.Chitin，chitosan and derivatives for wound healing and tissue engineering［J］.Adv Biochem Engin Biotechnol，2010，125:1 －27.

［6］Park BK，Kim MM.Applications of chitin and its derivatives in biological medicine［J］.Int J Mol Sci，2010，11(12):5152 －5164.

［7］Yu Ting，Li Honghe，Zheng Xiaodong.Synergistic effect of chitosan and cryptococcus laurentii on inhibition of Penicillium expansum infections［J］.Int J Food Microbiol，2007，114(3):261－266.

［8］Valentine R，Athanasiadis T，Moratti S，et al.The efficacy of a novel chitosan gel on hemostasis and wound healing after endoscopic sinus surgery［J］.Am J Rhinol Allergy，2010，24(1):70－75.

［9］Kawai T，Yamada T，Yasukawa A，et al.Biological fixation of fibrous materials to bone using chitin/chitosan as a bone formation accelerator［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2009，88B(1):264 －270.

［10］Teng SH，Lee EJ，Wang P，et al.Three-layered membranes of collagen/hydroxyapatite and chitosan for guided bone regeneration［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2008，87B(1):132－138.

［11］Lee EJ，Shin DS，Kim HE，et al.Membrane of hybrid chitosan– silica xerogel for guided bone regeneration［J］.Biomaterials，2009，30(5):743 －750.

［12］Kim K，F(xiàn)isher JP.Nanoparticle technology in bone tissue engineering［J］.J Drug TargeT，2007，15(4):241－252.

［13］Kubinová ?，Syková E. Nanotechnologiesin regenerative medicine［J］.Minim Invasive Ther Allied Technol，2010，19(3):144－156.

［14］孫康，王麗平.殼聚糖靜電紡納米纖維的制備和特點［J］.應(yīng)用化學(xué)，2011，28(2):123－130.

［15］Zeng Rong，Tu Mei，Liu hongwei，et al.Preparation，structure，drug release and bioinspired mineralization of chitosan-based nanocomplexes for bone tissue engineering［J］.Carbohydr Polym，2009，78(1):107－111.

［16］Zhao Jianhao，Han Wanqing，Chen Haodong，et al.Fabrication and in vivo osteogenesis of biomimetic poly(propylene carbonate)scaffold with nanofibrous chitosan network in macropores for bone tissue engineering［J］.J Mater Sci Mater Med，2011，23(2):517－525.

［17］Supaphol P，Suwantong O，Sangsanoh P，et al.Electrospinning of biocompatible polymers and their potentials in biomedical applications［J］.Adv Polym Sci，2011，246:213 －239.

［18］Jang JH，Castano O，Kim HW. Electrospun materials as potential platforms for bone tissue engineering［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61(12):1065 －1083.

［19］Ki CS，Park SY，Kim HJ，et al. Development of 3-D nanofibrous fibroin scaffold with high porosity by electrospinning:implications for bone regeneration ［J］.Biotechnol Lett，2007，30(3):405－410.

［20］Vaquette C，Cooper-White JJ.Increasing electrospun scaffold pore size with tailored collectors for improved cell penetration［J］.Acta Biomater，2011，7(6):2544 －2557.

［21］Lee JB，Jeong SI，Bae MS，et al.Highly porous electrospun nanofibers enhanced by ultrasonication for improved cellular infiltration［J］.Tissue Eng Part A，2011，17(21－22):2695－2702.

［22］Liverani L，Roether JA，Nooeaid P，et al.Simple fabrication technique for multilayered stratified composite scaffolds suitable for interface tissue engineering［J］.Mater Sci Eng A Struct Mater，2012，557:54－58.

［23］WangJianwen.，Chen Chingyi，KuoYiming. Effectof experimental parameters on the formation of chitosan-poly(acrylic acid)nanofibrous scaffolds and evaluation of their potential application as DNA carrier［J］.J Appl Polym Sci，2010，115(3):1769－1780.

［24］Grenha，A.Chitosan nanoparticles:a survey of preparation methods［J］.J Drug Target，2012，20(4):291 －300.

［25］Kalpana N，Shailendra KS，Dina NM.Chitosan nanoparticles:a promising system in novel drug delievry［J］.Chem Pharm Bull，2010，58(11):1423－1430.

［26］Mishra D，BhuniaB，BanerjeeI，etal. Enzymatically crosslinked carboxymethyl-chitosan/gelatin/nano-hydroxyapatite injectable gels for in situ bone tissue engineering application［J］.Mater Sci Eng C Mar Biol Appl，2011，31(7):1295 －1304.

［27］Couto D，Hong Zhongkui，Mano JF.Development of bioactive and biodegradable chitosan-based injectable systems containing bioactive glass nanoparticles［J］.Acta Biomater，2009，5(1):115－123.

［28］劉順振，侯玉東.骨組織工程支架材料的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(42):7911－7914.

［29］Shin SY，Park HN，Kim KH，et al.Biological evaluation of chitosan nanofiber membrane for guided bone regeneration［J］.J Periodontol，2005，76(10):1778 －1784.

［30］Cho WJ，Kim JH，Oh SH，et al.Hydrophilized polycaprolactone nanofiber mesh-embedded poly(glycolic-co-lactic acid)membrane for effective guided bone regeneration［J］.J Biomed Mater Res A，2009，91A(2):400－407.

［31］Chen Zonggang，Wei Bo，Mo Xiumei，et al. Mechanical properties of electrospun collagen–chitosan complex single fibers and membrane ［J］.Mater Sci Eng C Mar Biol Appl，2009，29(8):2428－2435.

［32］Norowski PA，Mishra S，Adatrow PC，et al.Suture pullout strength and in vitro fibroblast and RAW 264.7 monocyte biocompatibility of genipin crosslinked nanofibrous chitosan mats for guided tissue regeneration［J］.J Biomed Mater Res A，2012，100A(11):2890－2896.

［33］Datta P，Dhara S，Chatterjee J.Hydrogels and electrospun nanofibrous scaffolds of N-methylene phosphonic chitosan as bioinspired osteoconductive materials for bone grafting ［J］.Carbohydr Polym，2012，87(2):1354－1362.

［34］Thein-Han WW， Misra RDK. Biomimetic chitosannanohydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering［J］.Acta Biomater，2009，5(4):1182 －1197.

［35］Wang Shaofeng，Shen Lu，Zhang Weide，et al.Preparation and mechanical properties of chitosan/carbon nanotubes composites［J］.Biomacromolecules，2005，6(6):3067 －3072.

［36］Jafarkhani M，F(xiàn)azlali A，Moztarzadeh F，et al.Mechanical and structural properties of polylactide/chitosan scaffolds reinforced with nano-calcium phosphate ［J］.Iran Polym J，2012，21(10):713－720.

［37］Venkatesan J，Ryu B，Sudha PN，et al.Preparation and characterization of chitosan–carbon nanotube scaffolds for bone tissue engineering［J］.I J Biol Macromol，2012，50(2):393－402.

［38］Ma Xing，Wang Yang，Guo Hun，et al.Nano-hydroxyapatite/chitosan sponge-like biocomposite for repairing of rat calvarial critical-sized bone defect［J］.J Bioact Compat Polym，2011，26(4):335－346.

［39］Pattnaik S，Nethala S，Tripathi A，et al.Chitosan scaffoldscontaining silicon dioxide and zirconia nano particles for bone tissue engineering［J］.Int J Biol Macromol，2011，49(5):1167－1172.

［40］王瑋，尹慶水，張余.重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2殼聚糖納米微球的制備及體外細(xì)胞毒性［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(25):4611－4614.

［41］黃鑫，孟建國，劉建，等.rh-BMP-2殼聚糖微球的制備及體外檢測［J］.中國矯形外科雜志，2009.17(15):1172－1174.

［42］Hou Juan，Wang Jing，Cao Lingyan，et al.Segmental bone regeneration using rhBMP-2-loaded collagen/chitosan microspheres composite scaffold in a rabbit model［J］.Biomed Mater，2012，7(3):035002.

［43］Rieux A，Ucakar B，Mupendwa BPK，et al.3D systems delivering VEGF to promote angiogenesis for tissue engineering［J］.J Control Release，2011，150(3):272 －278.

［44］Jayakumar R，Chennazhi KP，Muzzarelli RAA，et al.Chitosan conjugated DNA nanoparticles in gene therapy［J］.Carbohydr Polym，2010，79(1):1－8.

［45］Nie H，Ho ML，Wang CK，et al.BMP-2 plasmid loaded PLGA/HAp composite scaffolds for treatment of bone defects in nude mice［J］.Biomaterials，2009，30(5):892 －901.

［46］盧華定，呂璐璐，趙慧清.轉(zhuǎn)化生長因子B1基因緩釋的殼聚糖納米粒制備及體外檢測［J］.中國組織工程研究，2012，16(12):2110－2124.

［47］Lai WF，Lin MCM.Nucleic acid delivery with chitosan and its derivatives［J］.J Control Release，2009，134(3):158 －168.

［48］Yu Wenyuan.A preliminary study on the evaluation of a novel gene delivery vector-TACS in vitro and in vivo via co-expressing hVEGF and hBMPgenes to repair critical-size rabbit bone defects［J］.J Pharm Pharmacol，2012，6(5):343 －351.