納米顆粒對(duì)豬GV期卵母細(xì)胞低溫保存效果的影響

李維杰 周新麗* 劉寶林 戴建軍 呂?？?張德福 徐 利

1(上海理工大學(xué)生物熱科學(xué)研究所，上海 200093)

2(上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室，上海 201106)

引言

生殖細(xì)胞的低溫保存是低溫生物醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容，可以使得優(yōu)秀或?yàn)l危的動(dòng)物品種突破時(shí)間和空間的限制，得以繁衍生息;可為不孕不育患者提供幫助。卵母細(xì)胞作為哺乳動(dòng)物的雌性配子由于體積大，對(duì)溫度敏感，1987年才真正得以保存，但效果并不理想［1］。目前保存卵母細(xì)胞效果最好的方式為Cryotop玻璃化保存卵母細(xì)胞，該方法利用體積最小的原理，將體積小于0.1μL的低溫保護(hù)液連同卵母細(xì)胞滴加到Cryotop載體上，迅速插入液氮，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞快速降溫，由于使用的低溫保護(hù)劑溶液體積小，降溫過(guò)程中直接插入液氮，降溫速度高，玻璃化程度高，對(duì)細(xì)胞損傷較小，因此存活率較高，但是仍然不十分理想。

為了突破制約當(dāng)前低溫保存的技術(shù)瓶頸，近年來(lái)出現(xiàn)了將納米技術(shù)與低溫工程學(xué)相結(jié)合的低溫保存策略——納米低溫保存。它是將具有生物相容性的納米顆粒加入低溫保護(hù)劑中，對(duì)細(xì)胞或組織實(shí)施離體保存。納米顆粒是直徑為1～100 nm的粒子，由于自身的小體積效應(yīng)，納米顆粒在強(qiáng)化傳熱、促進(jìn)成核、低溫保護(hù)劑性能改善等方面起到重要作用。郝保同等在低溫保護(hù)劑中加入納米微粒［2］，發(fā)現(xiàn)納米顆?？梢愿淖兊蜏乇Ｗo(hù)劑的傳熱系數(shù)和黏度，同時(shí)也可以改變冰晶的形成狀況，降低低溫保護(hù)劑的反玻璃化溫度，有利于細(xì)胞的低溫保存。徐海峰等認(rèn)為添加納米顆?？梢愿淖兊蜏乇Ｗo(hù)劑的結(jié)晶焓［3］。李方方數(shù)值模擬了納米冷凍過(guò)程溫度場(chǎng)和應(yīng)力場(chǎng)分布［4］，發(fā)現(xiàn)納米顆粒能強(qiáng)化散熱，增強(qiáng)力學(xué)性能，減少組織的溫度梯度，提高應(yīng)力承受能力。通常情況下低溫保護(hù)劑中加入納米微粒，可以有效提升保護(hù)劑的熱導(dǎo)率和黏度［5］。Hao等采用DSC測(cè)量了含有不同濃度納米顆粒的聚乙烯吡咯烷酮低溫保護(hù)劑的比熱容、玻璃化溫度和反玻璃化溫度［6］，結(jié)果表明其均隨納米顆粒的濃度增大而降低，溶液的導(dǎo)溫系數(shù)也能升高，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度卻降低4～7℃。常溫下，向乙二醇溶液中加入納米微粒能夠提高溶液的導(dǎo)熱系數(shù)［7］。Han發(fā)現(xiàn)添加0.2%(w/w)鉆石納米微粒到乙二醇溶液［8］，冷凍速率提高一倍，而導(dǎo)熱系數(shù)增加不超過(guò)5%，比熱容和潛熱量稍有降低，但成核溫度卻顯著升高。改變?nèi)芤旱慕Y(jié)晶性質(zhì)可以通過(guò)添加納米粒子來(lái)完成［9］。

學(xué)術(shù)界一直研究納米顆粒有利于細(xì)胞低溫保存的機(jī)理，很少應(yīng)用于實(shí)踐，本研究首先比較了粒徑20 nm的羥基磷灰石(HA)、二氧化硅(SiO2)、三氧化二鋁(Al2O3)、二氧化鈦(TiO2)納米顆粒在不同濃度下對(duì)卵母細(xì)胞的毒性，其次在安全濃度0.1%下，將各種納米粒子添加到低溫保護(hù)劑中，使用Cryotop法冷凍豬GV卵母細(xì)胞，比較顆粒種類(lèi)、粒徑、濃度等因素對(duì)細(xì)胞復(fù)溫后存活率的影響，然后對(duì)復(fù)溫后的細(xì)胞培養(yǎng)42 h，比較發(fā)育到MⅡ期的發(fā)育率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料

1.1.1 主要儀器和設(shè)備

BC－J160S CO2培養(yǎng)箱:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，中國(guó);TS100倒置熒光顯微鏡:Nikon，日本;YDS－35－20 液氮罐:東亞壓力容器，中國(guó);SW－CJ－1CU 超凈工作臺(tái):松泰凈化科技有限公司，中國(guó);Cryotop載板:KITAZATO，日本。

1.1.2 主要試劑

實(shí)驗(yàn)中所用的試劑除特別說(shuō)明外，均來(lái)自美國(guó)Sigma公司。TCM199培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS):Gibco公司，美國(guó)。納米顆粒(包括20 nm、40 nm 和60 nm HA納米顆粒，20 nm SiO2納米顆粒，20 nm Al2O3納米顆粒，20 nm TiO2納米顆粒):南京歐瑞納米科技有限公司，中國(guó)。

1.1.3 玻璃化冷凍/解凍液

基礎(chǔ)液:TCM199+20%FBS;預(yù)平衡液:基礎(chǔ)液+8%Me2SO+8% 乙二醇(ethylene glycol，EG);玻璃化冷凍液(vitrification solution，VS):基礎(chǔ)液 +15%Me2SO+15%EG+0.5 mol/L蔗糖;解凍液:分別以基礎(chǔ)液+0.5 mol/L蔗糖，基礎(chǔ)液+0.25 mol/L蔗糖構(gòu)成不同蔗糖濃度的解凍液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.2.1 豬卵母細(xì)胞的采集及GV期卵母細(xì)胞的獲得

卵巢采集于上海市長(zhǎng)寧區(qū)復(fù)興屠宰場(chǎng)。在豬屠宰后立即取卵巢組織，將采集的豬卵巢放入含1000 μg/mL雙抗生理鹽水中(35～37℃)，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用95%酒精對(duì)卵巢表面進(jìn)行噴灑消毒，再用滅菌的生理鹽水洗滌2～3次。選擇直徑為2～8 mm的卵泡，使用帶有大號(hào)針頭、20 mL的一次性注射器(注射器中裝有少量的TCMl99)將卵母細(xì)胞復(fù)合體連同卵泡液一起吸出。將抽出的卵泡液置于50 mm的培養(yǎng)皿中，在39℃恒溫臺(tái)上靜放10 min，移除上清液。取有3層以上卵丘細(xì)胞包裹且胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，洗滌3次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 納米顆粒毒性判定

分別添加0.05%、0.1%、0.5%，1%的粒徑為20 nm 的 HA、SiO2、Al2O3、TiO2，4 種納米顆粒到TCM199，將含有納米粒子的保護(hù)劑分別滴加到多孔板中，石蠟油液封，放在培養(yǎng)箱中預(yù)熱2 h，將GV期的卵母細(xì)胞加入含有納米顆粒的TCM199中，每孔加入卵50枚左右。培養(yǎng)42 h。成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞凈透明質(zhì)酸酶消化以去除卵丘細(xì)胞，用TCM199洗3～5遍備用。卵母細(xì)胞用熒光素雙醋酸酯(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)染色 3 min，再用基礎(chǔ)液洗3～4遍，在倒置顯微鏡下觀(guān)察是否著色。胚胎有熒光反應(yīng)的為活卵，沒(méi)有熒光反應(yīng)的為死卵。

1.2.3 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍及解凍程序

對(duì)照實(shí)驗(yàn)組所用冷凍保護(hù)劑為玻璃化冷凍液，實(shí)驗(yàn)組冷凍保護(hù)劑為玻璃化冷凍液中添加一定比例的納米顆粒，超聲震蕩，使其充分分散。

冷凍:將10枚卵母細(xì)胞為一組，從基礎(chǔ)液中移至預(yù)平衡液中平衡3 min，然后移至50 μL的玻璃化冷凍液中平衡30 s。用吸管將細(xì)胞滴加載到Cryotop載板上，再用毛細(xì)管移去一部分多余的冷凍保護(hù)劑，之后將帶有細(xì)胞的Cryotop快速插入液氮中，實(shí)施冷凍。

解凍:細(xì)胞冷凍72 h后，進(jìn)行細(xì)胞解凍。解凍采用三步法解凍。迅速將Cryotop裝置連同細(xì)胞一起從液氮中取出，先直接浸入37℃的基礎(chǔ)液+0.5 mol/L蔗糖液解凍，浸沒(méi)時(shí)間大約3 min。將卵母細(xì)胞快速移入37℃的基礎(chǔ)液+0.25 mol/L蔗糖液解凍，浸沒(méi)時(shí)間3 min。將卵母細(xì)胞快速移入37℃的TCM199基礎(chǔ)液。以此3個(gè)步驟，逐級(jí)脫除冷凍保護(hù)劑，實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞的完全解凍。

1.2.4 卵母細(xì)胞體解凍后存活率和發(fā)育率判斷

觀(guān)察解凍的細(xì)胞，對(duì)于卵丘覆蓋良好、形態(tài)完整的細(xì)胞可以認(rèn)為是存活的，反之，則認(rèn)為細(xì)胞死亡。存活細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)之比為存活率。

經(jīng)洗滌后的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體放入在培養(yǎng)箱內(nèi)已平衡4 h以上的成熟液(TCM199+10%FBS+10% 豬卵泡液 +激素)中，成熟培養(yǎng)42 h。成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞凈透明質(zhì)酸酶消化以去除卵丘細(xì)胞，用TCM199洗3～5遍備用。卵母細(xì)胞用FDA染色3 min，再用基礎(chǔ)液洗3～4遍，在倒置顯微鏡下觀(guān)察是否著色。有熒光反應(yīng)的為發(fā)育后的卵，沒(méi)有熒光反應(yīng)的為死卵。發(fā)育到MII的存活細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)之比為發(fā)育率。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS Statistics 17.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行顯著性分析，實(shí)驗(yàn)組之間采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同納米顆粒毒性

顆粒直徑為 20 nm 的 HA、SiO2、Al2O3、TiO2納米顆粒按照0.05%、0.1%、0.5%、1%的濃度(w/w)添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，經(jīng)過(guò)42 h的培養(yǎng)，納米顆粒均發(fā)生了很?chē)?yán)重的沉降和團(tuán)聚現(xiàn)象，吸附在細(xì)胞表面，使用毛細(xì)管口吸器可以將吸附在表面的納米顆粒打散，之后統(tǒng)計(jì)細(xì)胞發(fā)育率如表1。在較低濃度(＜0.1%)納米顆粒中培養(yǎng)的細(xì)胞均未死亡，都順利培養(yǎng)到MⅡ期。而當(dāng)濃度為0.5%時(shí)，HA依舊對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，而其它納米顆粒(SiO2、Al2O3、TiO2)會(huì)影響細(xì)胞的發(fā)育，當(dāng)納米顆粒的濃度達(dá)到1%時(shí)，所有的納米顆粒均影響細(xì)胞發(fā)育。

表1 不同納米顆粒對(duì)豬GV期卵母細(xì)胞的毒性Tab.1 The toxicity of different nanoparticles on the porcine GV-stage oocytes

2.2 不同的納米顆粒對(duì)細(xì)胞冷凍效果的影響

將濃度為0.1%、粒徑為20 nm的 HA、SiO2、Al2O3、TiO2的納米顆粒添加到玻璃化冷凍液中，使用Cryotop法進(jìn)行冷凍，發(fā)現(xiàn)添加納米顆粒之后低溫保存效果差異較大，結(jié)果如表2。解凍后直接觀(guān)察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率較高，卵母細(xì)胞出現(xiàn)破裂、變形等情況的概率不大，大部分卵形態(tài)完整，值得注意的是添加了Al2O3納米顆粒的卵的形態(tài)完好性較低為92%，而未添加和添加其他納米的組都在98%以上，但是各組差異不顯著。對(duì)冷凍后的卵培養(yǎng)42 h觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，加入HA納米顆粒的組比不加入納米顆粒的組發(fā)育率有了顯著的增加，高達(dá)22%，而對(duì)照組僅為14%，添加SiO2盡管也有提高(16%)但不顯著，而Al2O3和TiO2居然有反作用，存活率分別為2%和6%，遠(yuǎn)低于對(duì)照。

表2 不同種類(lèi)納米顆粒對(duì)豬GV期卵母細(xì)胞的冷凍效果Tab.2 The effect of different nanoparticles on cryopreservation of porcine GV-stage oocytes

2.3 不同粒徑的納米顆粒對(duì)冷凍效果的影響

將濃度為0.1%粒徑為20、40、60 nm的HA納米顆粒添加到冷凍保護(hù)液中，使用Cryotop法冷凍，結(jié)果如表3。添加了納米顆粒的實(shí)驗(yàn)組冷凍后卵的形態(tài)完整性較未添加組有所提高，但不顯著。當(dāng)培養(yǎng)42 h后，卵由GV期發(fā)育為MⅡ期的比例有所增加，比對(duì)照的14.2%，有顯著增加，其中40、60 nm顆粒的效果較好，發(fā)育率均為28.7%，而20 nm實(shí)驗(yàn)組發(fā)育率相對(duì)較低為26.7%，而各實(shí)驗(yàn)組之間沒(méi)有顯著差異。

表3 納米顆粒粒徑對(duì)對(duì)豬GV期卵母細(xì)胞的冷凍效果Tab.3 The effect of particle size on cryopreservation of porcine GV-stage oocytes

2.4 羥基磷灰石濃度對(duì)卵母細(xì)胞低溫保存效果的影響

將60 nm的 HA以 0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.5%濃度添加到玻璃化保存液中，進(jìn)行冷凍、復(fù)溫、培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組50個(gè)左右，結(jié)果如表4。添加了60 nmHA顆粒之后，復(fù)溫后卵細(xì)胞形態(tài)完整性較未添加有所提高，但不顯著。當(dāng)培養(yǎng)42 h后，差異性十分明顯，分別添加 0.01%、0.02%、0.05%和0.1%的組發(fā)育率顯著提高，但組別之間區(qū)別不顯著，其中添加0.05%的組發(fā)育率最高，達(dá)到30.4%比對(duì)照組的一倍還多。而添加0.5%的組也有提高，但與對(duì)照差異不顯著。

表4 HA濃度對(duì)對(duì)豬GV期卵母細(xì)胞的冷凍效果Tab.4 The effect of HA concentration on cryopreservation of porcine GV-stage oocytes

3 討論

添加納米顆粒到培養(yǎng)液中會(huì)影響細(xì)胞的發(fā)育，這是由于顆粒本身體積較小，具有表面吸附等小體積效應(yīng)，可以吸附培養(yǎng)基中的化學(xué)成分，改變pH值和營(yíng)養(yǎng)組成，造成細(xì)胞死亡，同時(shí)，由于顆粒較小，在培養(yǎng)過(guò)程中可能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，和細(xì)胞器以及染色體相結(jié)合，影響細(xì)胞器的發(fā)育［10－11］。由于HA自身穩(wěn)定性等原因的影響，毒性相對(duì)較低，在0.5%時(shí)未對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)造成影響［12］。當(dāng)納米粒子濃度達(dá)到1%，所有的細(xì)胞都受到了不同程度的影響，只是HA的毒性相對(duì)較小，對(duì)細(xì)胞的影響不大，而其它三種尤其Al2O3的毒性較大，成活率太低?？梢哉J(rèn)為，納米顆粒低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞毒性小，高濃度對(duì)細(xì)胞毒性大。當(dāng)納米粒子濃度高于0.5%時(shí)也會(huì)發(fā)生很?chē)?yán)重的團(tuán)聚現(xiàn)象，影響培養(yǎng)、冷凍等操作過(guò)程，而低濃度時(shí)團(tuán)聚現(xiàn)象不明顯，便于操作。此外考慮到納米顆粒在分子水平對(duì)細(xì)胞染色體的損傷不能通過(guò)FDA染色觀(guān)察到，因此盡量在低濃度區(qū)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)，為了保證納米粒子在冷凍過(guò)程中的效果，濃度亦不能太低。

納米顆粒的種類(lèi)影響著冷凍和復(fù)溫過(guò)程的結(jié)晶和重結(jié)晶過(guò)程。冷凍過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的物理過(guò)程，而加入納米顆?？梢允贵w系的玻璃化和重結(jié)晶過(guò)程更加復(fù)雜。一方面加入納米顆?？梢詮?qiáng)化散熱，增加導(dǎo)熱系數(shù)，減少反玻璃化結(jié)晶［13］，有利于細(xì)胞保存，另一方面可以促進(jìn)溶液成核，不利于玻璃化。在成核與反玻璃化的博弈中，當(dāng)玻璃化占優(yōu)勢(shì)時(shí)，就能提升細(xì)胞的存活率，反之可能降低存活率。由于納米顆粒的物理性質(zhì)與種類(lèi)相關(guān)，其對(duì)細(xì)胞玻璃化保存效果的影響也有所不同。

研究HA納米顆粒的粒徑對(duì)細(xì)胞發(fā)育率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，粒徑對(duì)發(fā)育率影響不大，這是由于商品化的納米顆粒并不是都保證為一個(gè)尺寸，其尺寸范圍為一個(gè)很廣的區(qū)間，標(biāo)示60 nm的顆粒，其成分中含有20 nm和40 nm的成分，只是60 nm占主要，同理其它粒徑的納米顆粒的粒徑分布也很廣，因此樣本的差異性并不很大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異性不大也在所難免。此外，納米顆粒對(duì)冰晶的結(jié)晶性質(zhì)的影響是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程［2］，是多方因素共同作用的結(jié)果，納米顆粒的粒徑對(duì)于結(jié)晶性質(zhì)只是一個(gè)很小的影響因素。

羥基磷灰石的加入提高了GV期卵母細(xì)胞的冷凍存活率和發(fā)育率。當(dāng)HA濃度達(dá)到0.05%時(shí)，反玻璃化效果最好，保存效果亦最好。原因可能是低溫保護(hù)劑中添加適當(dāng)濃度的納米顆粒，可以改善溶液結(jié)晶性，減少冰晶數(shù)量，有利于細(xì)胞低溫保存效果，也可能是低溫保護(hù)劑中添加納米顆粒減少了復(fù)溫過(guò)程的重結(jié)晶。在一定的濃度范圍內(nèi)，納米顆粒對(duì)細(xì)胞低溫保存有效果，超過(guò)該范圍反而對(duì)細(xì)胞有毒性。不同的顆粒的范圍可能不同，由于實(shí)驗(yàn)量和精力的限制，只找到了HA納米顆粒的較有益濃度。由于其它的納米顆粒和HA的理化性質(zhì)不同，在其它的濃度范圍內(nèi)，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞冷凍保存也有積極作用。

4 結(jié)論

不同種類(lèi)的納米顆粒對(duì)細(xì)胞的毒性不同，一般低濃度時(shí)毒性低，高濃度時(shí)毒性高，會(huì)殺死細(xì)胞。在低溫保護(hù)劑中添加適宜濃度的HA納米顆粒，可以減少?gòu)?fù)溫過(guò)程中的重結(jié)晶現(xiàn)象，促進(jìn)細(xì)胞的冷凍存活率和發(fā)育率，保存效果與濃度相關(guān)，而與納米顆粒的粒徑關(guān)系不大。

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