中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成及其在肝臟炎癥中作用的研究進(jìn)展

支建博，楊茜雅，謝 磊，官艷東，董強

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)是2004年首次報道發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)構(gòu)，具有免疫防御等作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，NETs與一系列疾病過程有關(guān)，包括自身免疫性疾病、血栓形成和寄生蟲病[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體形成的NETs可以對組織器官(如眼睛、肝臟和腎臟)的炎癥造成影響甚至導(dǎo)致疾病的進(jìn)一步惡化。其中肝臟炎癥是影響動物和人類代謝功能和健康的一大類疾病，NETs一方面可預(yù)防炎癥的發(fā)生、緩解炎癥導(dǎo)致的損傷，另一方面也與炎癥程度的加劇和組織的損傷有關(guān)。迄今為止，NETs對肝臟炎癥影響的研究并不系統(tǒng)和深入。本文按非吞噬細(xì)胞氧化酶(NOX)依賴的方式和NOX非依賴的方式概述了NETs生成的機(jī)制，總結(jié)了NETs在肝臟感染性炎癥、酒精性肝炎等不同炎癥中作用的研究進(jìn)展，以期為以NETs中相關(guān)分子作為肝臟炎癥診治靶點的研究提供依據(jù)。

1 NETs形成的機(jī)制

NETs形成過程中，中性粒細(xì)胞發(fā)生的有別于凋亡和壞死的死亡程序統(tǒng)稱為NETosis。NETosis的機(jī)制主要分為2種，即非吞噬細(xì)胞氧化酶(non-phagocytic cell oxidase,NOX)家族中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶依賴的NETosis和NOX非依賴性的NETosis。炎癥激動劑佛波脂(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可以分別通過不同的機(jī)制誘導(dǎo)NOX依賴的NETs形成[4-5]。在PMA的刺激下，胞漿中Ca2+濃度升高，蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)被活化，使NOX的核心成分gp91phox/NOX2磷酸化激活NOX[6]。這一過程促進(jìn)了NOX的組裝，從而推動了活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，ROS隨后會分解中性粒細(xì)胞中的顆粒與核膜[7]。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)通常包含在嗜天青顆粒中，受到ROS攻擊后，從顆粒中逃逸出來移位到細(xì)胞核，降解組蛋白，并協(xié)同促進(jìn)染色質(zhì)的解凝。這一過程最終導(dǎo)致中性粒細(xì)胞膜完整性的喪失，去凝聚的脫氧核糖核苷酸(DNA)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。LPS誘導(dǎo)的NOX依賴的NETs形成是通過c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)介導(dǎo)的一個單獨途徑實現(xiàn)的。JNK作為一種分子開關(guān)，可與中性粒細(xì)胞表面的Toll樣受體4(Toll-like receptors 4,TLR4)結(jié)合激活信號傳導(dǎo)途徑。LPS濃度增加時，JNK的磷酸化程度逐漸升高而被激活，激活后的JNK在NOX活化的過程中發(fā)揮了作用，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，最終啟動NETosis[8]。NOX非依賴性的NETosis的啟動方式可由離子霉素等Ca2+載體激活來誘導(dǎo)。Ca2+載體可激活中性粒細(xì)胞的小電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道(small conductance Ca2+-activated K+channel 3,SK3通道)，誘導(dǎo)線粒體ROS的形成。線粒體ROS激活了NOX非依賴的NETs形成所特有的激酶，例如細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和JNK等。這些激酶激活轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄激活，這一過程使染色質(zhì)解縮成為可能。該途徑精氨酸脫亞氨酶4(peptidyl arginine deiminase 4,PAD4)被線粒體ROS激活，致使大量的PAD4存在于胞漿中并在離子霉素作用下與Ca2+結(jié)合，再移位到中性粒細(xì)胞核。活化的PAD4將組蛋白中帶有正電荷的精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，導(dǎo)致正電荷丟失，破壞DNA和組蛋白之間的靜電作用，并使染色質(zhì)解聚。NE和MPO等酶進(jìn)入細(xì)胞核后，可修飾染色質(zhì)并使核膜降解，促進(jìn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成。蛋白Gasdermin D可使細(xì)胞膜形成孔隙，使NETs得以釋放[9-10]。

2 NETs在肝臟感染性炎癥中的作用

肝臟感染性炎癥由多種病原微生物感染引起，包括細(xì)菌、真菌、病毒以及寄生蟲等。在發(fā)生感染后，組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞和其他前哨細(xì)胞會分泌炎性細(xì)胞因子和趨化因子，這些細(xì)胞因子和趨化物質(zhì)能夠招募和激活中性粒細(xì)胞。中性粒細(xì)胞作為最早到達(dá)感染部位的效應(yīng)細(xì)胞之一，在病原體清除、募集等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。中性粒細(xì)胞采用3種主要策略來對抗微生物，即吞噬、脫顆粒和釋放NETs[12-14]NETs是由去凝集的染色質(zhì)與30多種不同的中性粒細(xì)胞蛋白組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。感染性因素引起的炎癥與血漿中組蛋白的出現(xiàn)有關(guān)，NETs包含所有類型的組蛋白，并以濃度依賴的方式引起細(xì)胞毒性。NETs的另一組分MPO的活性也可以引起鄰近組織的損傷[5]。此外，NETs的形成還會引起巨噬細(xì)胞浸潤，并分泌炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor,TNF-α)，導(dǎo)致炎癥加劇[15]。

2.1 NETs在細(xì)菌感染中的形成和作用

金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌是兩種引起肝臟感染最主要的病原菌。它們刺激中性粒細(xì)胞后，細(xì)胞會產(chǎn)生含有去凝集的染色質(zhì)和顆?？咕鞍椎哪遗?，形成NETs并釋放到胞外空間。已知TLR和補體是關(guān)鍵的先天防御系統(tǒng)成分，在細(xì)菌感染后迅速被觸發(fā)。有證據(jù)表明，補體和TLR信號通路之間通過相互作用增強先天免疫[16]。NETs的形成過程依賴于TLR2和補體因子3(complement 3,C3)，因為在缺乏TLR和C3時，中性粒細(xì)胞無法釋放NETs的關(guān)鍵組分組蛋白與核DNA[17]。NETs重要組分組蛋白和NE等不但具有殺菌和抗菌特性[18]，還可以形成一道物理屏障，防止病原菌的傳播[19]。髓系相關(guān)蛋白14是一種中性粒細(xì)胞胞漿蛋白，它與NETs一起排出并發(fā)揮抗菌作用[20]。

2.2 NETs在寄生蟲感染時的形成和作用

肝臟組織內(nèi)的寄生蟲主要有華支睪吸蟲、肝片形吸蟲和肝毛細(xì)線蟲等。有研究證明，巨型肝片吸蟲幼蟲(excysted juveniles ofFasciolagigantica)能夠誘導(dǎo)水牛中性粒細(xì)胞形成NETs。而形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠誘捕這種吸蟲，但不影響其存活率和完整性。研究結(jié)果提示，NETs的形成很可能通過阻礙大型幼蟲的遷移，以促進(jìn)免疫細(xì)胞對它們的殺滅[21]。

2.3 NETs在真菌感染中的形成和作用

念珠菌病在肝臟真菌感染中的發(fā)病率最高。最常見病原為白色念珠菌，一種真核病原體，能夠激活中性粒細(xì)胞。該細(xì)胞通過C型凝集素受體Dectin-1識別真菌的大小，若過大無法通過吞噬作用清除，則通過識別真菌成分，如β-葡聚糖、純化的天冬氨酸蛋白酶等促進(jìn)NETs形成的因子，誘導(dǎo)NETs形成。然而，其他分子，如真菌磷脂酶可激活PKC，而PKC的激活是誘導(dǎo)NETs形成的原始步驟，也能夠使中性粒細(xì)胞中DNA釋放，促進(jìn)NETs的生成[22]。NETs特有的網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)可殺死念珠菌，纖維中的顆粒蛋白包含乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)和MPO，能有效殺滅白色念珠菌菌絲和酵母菌。此外，NETs中的組蛋白具有陽離子性質(zhì)，在促進(jìn)真菌病原體與NETs的結(jié)合方面發(fā)揮重要作用[23]。

2.4 NETs在病毒感染中的形成與作用

乙型肝炎病毒(HBV)作為肝臟最主要的病毒性感染源之一，可引起多種肝病。NETs作為重要的免疫防御機(jī)制可能參與了乙型肝炎病毒(HBV)的持續(xù)性感染。研究表明，在經(jīng)病毒內(nèi)含有的HBVc或HBVe蛋白處理的細(xì)胞中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)和ERK1/2的磷酸化水平顯著降低，使ERK和p38MAPK通路參與的ROS產(chǎn)生被抑制；其次，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白活性被增強，可通過負(fù)性調(diào)節(jié)與自噬機(jī)制相關(guān)的蛋白質(zhì)來抑制自噬的啟動。已知自噬能夠通過多種機(jī)制參與NETs的形成，所以HBV主要是以這兩種方式來抑制NETs釋放[24]。HBV感染后中性粒細(xì)胞和血小板重新聚集到肝血管系統(tǒng)，通過促進(jìn)NETs釋放來保護(hù)宿主細(xì)胞免受病毒的感染，結(jié)果表明NETs 在預(yù)防病毒感染方面具有重要的作用，但具體機(jī)制需進(jìn)一步探究[25]。

3 NETs在酒精性肝炎中的形成和作用

酒精性肝炎時，酒精的快速攝入會促進(jìn)中性粒細(xì)胞在肝臟中的顯著滲透，并導(dǎo)致中性粒細(xì)胞免疫失衡，從而誘導(dǎo)NETs的釋放。研究發(fā)現(xiàn)，NETs的形成依賴于病原體相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs)中的LPS和損傷相關(guān)的分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPS) 中的高遷移率族蛋白B1，它們可以激活中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致NETs的釋放。CXC趨化因子配體(CXC chemokine ligand,CXCL)，如CXCL1和CXCL2等對中性粒細(xì)胞募集和維持中性粒細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。重組CXCL1可改善中性粒細(xì)胞募集，并促進(jìn)NETs形成[26]。酒精的作用可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的肝臟中高遷移率族蛋白B1升高，從而使中性粒細(xì)胞NETs的形成減少，可能導(dǎo)致其抗菌能力減弱。同時，也可使巨噬細(xì)胞對NETs的清除作用減弱， NETs大量積累并產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。原因是由于其成分組蛋白帶有正電荷，易于與帶有負(fù)電荷的磷脂細(xì)胞膜結(jié)合，造成細(xì)胞膜的導(dǎo)電性增高，并導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，引起膜損傷[27]。組蛋白也可作用于TLR，通過其介導(dǎo)的信號通路，活化炎性細(xì)胞與免疫細(xì)胞，引起炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，最后導(dǎo)致肝臟炎癥的加劇和組織損傷[28]。

4 NETs在非酒精性脂肪肝病中的形成和作用

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)引起的肝損傷的表現(xiàn)為肝細(xì)胞損傷、細(xì)胞死亡以及纖維化。非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)作為NAFLD的一類，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受營養(yǎng)、遺傳、代謝和炎癥因素的影響[29]。目前研究已具體到一些相關(guān)外周代謝信號的調(diào)控作用。研究表明，用蛋氨酸缺乏性高脂飼料處理小鼠，來誘導(dǎo)早期脂肪肝損傷的發(fā)生時，作者提出，鞘氨醇1-磷酸(S1P)是細(xì)胞膜鞘磷脂代謝的產(chǎn)物，通過其受體(S1PRs)誘導(dǎo)多種細(xì)胞的浸潤和激活，調(diào)節(jié)重要的生理和病理活動。其機(jī)制是在SIPR2介導(dǎo)下，由SIP誘導(dǎo)的、通過依賴ERK、p38MAPK、ROS等信號通路將中性粒細(xì)胞的凋亡重新定向至NETosis。據(jù)報道，NETs能刺激枯否氏細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子和趨化因子來引起肝臟損傷，該研究的結(jié)果揭示SIPR2基因的敲除通過減少NETs的形成來顯著降低炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT)的水平以及組織學(xué)上的炎癥和纖維化程度[30]。此外，非酯化脂肪酸(NEFAs)、油酸(OA)和亞油酸(LA)通過Pannexin1和P2X1的激活來誘導(dǎo)ATP的釋放和NETs的形成[31]。在 MPO 缺失的非酒精性肝炎小鼠中，肝細(xì)胞的纖維化和損傷程度顯著下降，緩解了NASH的進(jìn)程[32]。此外，通過抑制 NE 基因的表達(dá)可降低NASH小鼠肝臟脂肪變性，并減緩炎癥加劇。上述試驗結(jié)果表明，NETs通過 MPO和NE 在NASH 中發(fā)揮對肝臟的損傷作用。研究也為通過抑制NETs的生成來治療NASH提供了試驗和理論基礎(chǔ)[33-34]。

5 NETs在自身免疫性肝炎中的形成和作用

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一種急性或慢性肝實質(zhì)疾病，其特征是對肝細(xì)胞特異性自身抗原缺乏耐受性?？筛鶕?jù)抗核抗體(antinuclear antibody，ANA) 和抗平滑肌抗體將 AIH分為1型AIH(ANA和/或抗平滑肌抗體陽性)和 2 型 AIH(肝-腎微粒體1型抗體或肝細(xì)胞溶膠1型抗體陽性)兩類[35]。雖然AIH中產(chǎn)生ANA的機(jī)制尚不明確，但AIH中的抗DNA、抗組蛋白、抗著絲粒、抗染色質(zhì)、抗核糖核蛋白和抗細(xì)胞周期蛋白A抗體參與了ANA反應(yīng)，而染色質(zhì)、組蛋白和 DNA 均為 NETs 的成分，提示ANA與 NETs 形成有關(guān)[36]。AIH的病因以及該過程中NETs產(chǎn)生的機(jī)制尚不清楚，但在炎癥的早期中性粒細(xì)胞的浸潤以及與NETs組分對應(yīng)的蛋白抗體提示NETs的確參與了該類炎癥的過程。

6 結(jié)語

本文綜述了NETs在幾種肝臟炎癥中的形成機(jī)制與作用，其成分具有良好的殺滅病原微生物的能力，對肝臟炎癥具有重要作用，但過度的NETs形成具有促炎特性。在動物模型中，抑制NETs形成在大多數(shù)無菌損傷的情況下是有益的，而在感染性炎癥中NETs的形成也不是完全有利的。需要進(jìn)一步明確其形成的分子機(jī)制及涉及的各類信號途徑、深入評估NETs的生成在各類肝臟炎癥中的利弊，為利用NETs在炎癥中表現(xiàn)出的優(yōu)勢和開發(fā)特異性的藥物提供理論依據(jù)。