舒芬太尼后處理通過ERK1/2介導(dǎo)的p70S6K信號(hào)通路對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

聞 穎，吳巧玲，劉國利

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，遼寧 錦州 121000)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是指由缺血和恢復(fù)進(jìn)入先前缺血組織的血流引起的對(duì)心肌的損傷。再灌注后，心肌超微結(jié)構(gòu)、功能、代謝和電生理特征進(jìn)一步受損，出現(xiàn)血壓突然下降、心率下降甚至猝死[1-2]。 MIRI可對(duì)心肌細(xì)胞造成不可逆的損傷，并降低細(xì)胞活性。 目前公認(rèn)MIRI的主要機(jī)制包括釋放過量的鈣、釋放炎癥因子和細(xì)胞凋亡[3]。已有研究[4-8]證實(shí)：MIRI誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是急性MIRI的主要形式。目前，已經(jīng)鑒定出3種調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途徑[9]。

促活化激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)和細(xì)胞外信號(hào)激酶1/2(extracellular-signal regulated kinase，ERK1/2)，在缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/R)過程中該途徑被激活，可以保護(hù)心臟免受再灌注損傷[10]。p70核糖體蛋白S6激酶(p70 ribosomal protein S6 kinase,p70S6K) 是一種屬于環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)依賴性蛋白激酶家族的激酶[11]，在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，包括蛋白質(zhì)合成、mRNA加工、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞生長和存活[12]。p70S6K 作為ERK信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)，控制著翻譯元件的生物合成，參與蛋白質(zhì)合成[13]。

舒芬太尼(sufentanil，Sufen)是一種特異性的μ-阿片受體激動(dòng)劑，具有強(qiáng)大的脂溶性和對(duì)人體血漿蛋白的高附著率，具有強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用，常用于心臟手術(shù)患者。研究[14]顯示:舒芬太尼在I/R心肌損害中發(fā)揮重要作用，但是目前有關(guān)ERK1/2介導(dǎo)的p70S6K 信號(hào)通路對(duì)大鼠I/R的保護(hù)機(jī)制研究較少。本研究通過構(gòu)建大鼠MIRI模型，探討舒芬太尼對(duì)大鼠MIRI的保護(hù)作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用舒芬太尼提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器SPF級(jí)SD雄性大鼠72只，體質(zhì)量200～250 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0010，在溫度(20±2)℃、相對(duì)濕度(55±5)%條件下飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南。舒芬太尼注射液(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)，戊巴比妥鈉(上海泰瑞爾生物技術(shù)有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)和ERK抑制劑PD98059(美國Sigma 公司)，磷酸化ERK(p-ERK)小鼠多克隆抗體和磷酸化p70S6K(p-p70S6K)小鼠多克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。ALC-v8d動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特有限公司)，監(jiān)護(hù)儀M3046A(美國Philips公司)。

1.2 大鼠MIRI模型的制備大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉50 mg·kg-1麻醉及500 U·kg-1肝素化后，取仰臥位固定四肢，連接皮下電極連續(xù)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，頸部正中分離氣管并切開氣管進(jìn)行插管，用動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，潮氣量設(shè)為2 mL·100 g-1，通氣頻率70 min-1。右頸總動(dòng)脈插入24號(hào)套管針連接壓力換能器，持續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(mean arterial blood pressure，MAP)和心率(heart rate，HR)，左側(cè)頸內(nèi)靜脈置管作為藥物輸液通道，使用加熱毯將體溫維持在(36.5±1.0)℃。于胸骨左緣打開胸腔并剪開心包膜，暴露心臟，以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，以6.0的無損傷縫合線在左心耳下方1～2 mm作線結(jié)，針深約1.5 mm，于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間出針，將直徑為2 mm長度為0.5 cm的聚乙烯管套于線的末端，同時(shí)以持針器夾緊縫合線造成缺血和松開縫合線模擬再灌注。將結(jié)扎后心電圖ST段明顯升高、結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌顏色蒼白作為心肌缺血的標(biāo)志，釋放后最初蒼白區(qū)域的充血反應(yīng)是再灌注成功的標(biāo)志。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組72只SD雄性大鼠隨機(jī)分為6組，每組12只。假手術(shù)組：大鼠手術(shù)時(shí)只掛線不結(jié)扎，持續(xù)灌注150 min；缺血再灌注組(I/R組)：缺血30 min，再灌注120 min；DMSO組：制備大鼠心臟I/R模型，于再灌注前5 min給予<0.2%的DMSO；舒芬太尼后處理組(Sufen組)：于再灌注前3 min給予1 μg·kg-1舒芬太尼(用生理鹽水稀釋至1 mL舒芬太尼注射液)；PD組：再灌注前5 min 給予20 μmol·L-1PD98059(1.0 g PD98059溶于150 mL DMSO中)；PD98059+舒芬太尼后處理組(PD+Sufen組)：于再灌注前3和5 min分別給予1 μg·kg-1舒芬太尼和20 μmol·L-1PD98059。

1.4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)大鼠右頸總動(dòng)脈插入24號(hào)套管針連接壓力換能器，于缺血前即刻(T0)和再灌注30 min(T1)、60 min(T2)、90 min(T3)、2 h(T4)持續(xù)監(jiān)測(cè)MAP和HR。

1.5 大鼠心肌梗死面積檢測(cè)于再灌注2 h后迅速取出大鼠心臟，用心臟分割器分割為5～6塊，切成2 mm厚組織。分割后的心臟置于1% 2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)中振蕩染色，避光恒溫孵育20 min。PBS緩沖液沖洗后使用10%甲醛固定24 h，觀察心肌梗死范圍。梗死區(qū)為灰白色，非梗死區(qū)為磚紅色，使用Alpha View 凝膠圖像分析系統(tǒng)分析。心肌缺血面積以缺血區(qū)心肌質(zhì)量/左室質(zhì)量(AAR/LV)表示，心肌梗死面積以梗死區(qū)心肌質(zhì)量/缺血區(qū)心肌質(zhì)量(IS/AAR)表示。

1.6 Western blotting 法檢測(cè)大鼠心肌組織中p-ERK1/2和p-p70S6K 蛋白表達(dá)水平取約300 mg 大鼠左心室，剪碎，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑(PMSF)，低溫下超聲細(xì)胞破碎儀裂解3次。取上清的心肌組織提取液，使用BCA進(jìn)行蛋白定量，每組取30 μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。一抗為p-ERK1、p-ERK2和p-p70S6K。二抗為HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠二抗，用ECL發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參校正上樣誤差，凝膠成像儀拍照。Image J軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 不同時(shí)間各組大鼠MAP和HR與T0時(shí)比較，T1～T4時(shí)I/R組、Sufen組、DMSO組、PD組和PD+Sufen組大鼠MAP和HR均明顯降低(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，T1～T4時(shí)其他各組大鼠MAP和HR均降低(P<0.05)；與I/R組比較，T3時(shí)Sufen組大鼠MAP降低(P<0.05)，HR明顯升高(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)各組大鼠MAP和HR差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠心肌梗死面積與I/R組比較，Sufen組大鼠心肌梗死面積明顯減少(P<0.05)；與Sufen組比較，PD組和 PD+Sufen組大鼠心肌梗死面積明顯增加(P<0.05)；I/R組、DMSO組、PD組和PD+Sufen組大鼠心肌梗死面積組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠MAP和HR

表2 各組大鼠心肌梗死面積

2.3 各組大鼠心肌組織中p-ERK1/2和p-p70S6K 蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，I/R 組、Sufen組和DMSO 組大鼠心肌組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平及PD組、PD+Sufen組、I/R 組、Sufen組和DMSO 組大鼠心肌組織中p-p70S6K 蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；與I/R 組比較，Sufen組大鼠心肌組織中p-ERK1/2和p-p70S6K蛋白表達(dá)水平均進(jìn)一步升高(P<0.05)，PD組和PD+Sufen組大鼠心肌組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與Sufen組比較，PD+Sufen組大鼠心肌組織中p-p70S6K和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見圖1和圖2。

Lane 1: Sham group; Lane 2: PD group; Lane 3: PD+Sufen group; Lane 4:I/R group; Lane 5: Sufen group; Lane 6:DMSO group.

3 討 論

心肌缺血再灌注是急性心力衰竭的主要原因。MIRI后不完全修復(fù)和纖維組織增生可導(dǎo)致持續(xù)性心肌損傷，并逐漸發(fā)展為慢性心力衰竭，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重危害[15]。已有研究[16]表明：舒芬太尼在心肌缺血再灌注中可以特異性地保護(hù)心肌功能。舒芬太尼后處理對(duì)MIRI的保護(hù)作用一直是研究的熱點(diǎn)，但其機(jī)制復(fù)雜，存在很多爭議。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了MIRI大鼠模型，測(cè)定大鼠心肌缺血再灌注末的心功能指標(biāo)和心肌梗死范圍，結(jié)果顯示：Sufen 組大鼠MAP、HR均高于I/R 組，心肌梗死范圍低于I/R 組，舒芬太尼后處理能夠改善大鼠心功能指標(biāo)，減少M(fèi)IRI后的心肌梗死面積，表明舒芬太尼對(duì)MIRI后的心肌具有保護(hù)作用；與I/R組比較， PD+Sufen組大鼠MAP、HR及心肌梗死面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明作為ERK抑制劑的PD98059抑制了舒芬太尼后處理的心肌保護(hù)作用，也證明了舒芬太尼后處理的保護(hù)作用機(jī)制與ERK信號(hào)通路有關(guān)。

1: Sham group; 2: PD group; 3: PD+Sufen group; 4:I/R group; 5: Sufen group; 6:DMSO group.*P<0.05 compared with Sham group; △P<0.05 compared with I/ R group; #P<0.05 compared with Sufen group.

研究[17]顯示：舒芬太尼可以通過ERK1/2信號(hào)通路途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)MIRI的保護(hù)作用。在正常心肌細(xì)胞中ERK1/2呈低表達(dá)，但是當(dāng)受到I/R刺激時(shí)，ERK1/2被激活并表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠心肌組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯升高，而Sufen組大鼠心肌組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步高于I/R組，表明舒芬太尼后處理通過增加p-ERK1/2的表達(dá)激活ERK信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮對(duì)MIRI后大鼠心肌的保護(hù)作用；而PD+Sufen組大鼠心肌組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯低于Sufen組，表明給予PD98059后其心肌保護(hù)作用消失，進(jìn)一步說明舒芬太尼后處理通過激活ERK信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)大鼠的心肌保護(hù)作用。

吳宥熹等[18]研究證明：葒草苷在大鼠缺血再灌注模型中對(duì)心肌的保護(hù)作用是通過ERK調(diào)節(jié)其下游靶點(diǎn)p70S6K的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。 張靜等[19]證實(shí)：七氟醚后處理可能通過p70S6K參與了心肌保護(hù)作用。CHEN等[20]證實(shí)：可以通過激活p70S6K減輕MIRI。p-p70S6K是ERK信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)，參與合成蛋白質(zhì)。本研究結(jié)果顯示：大鼠心肌組織中 p-p70S6K蛋白表達(dá)水平隨著p-ERK1/2表達(dá)水平的升高而升高，且與I/R組比較，Sufen組大鼠心肌組織中p-p70S6K蛋白表達(dá)水平明顯升高，說明p70S6K的磷酸化依賴于ERK信號(hào)通路的激活，同時(shí)PD能抑制p70S6K的活性。作為ERK1/2的抑制劑，PD能完全抑制ERK1/2的磷酸化，卻不能有效抑制p70S6K的磷酸化，可能還存在其他的信號(hào)通路調(diào)節(jié)p70S6K的磷酸化。

綜上所述，舒芬太尼后處理激活ERK1/2信號(hào)通路，使ERK1/2磷酸化，進(jìn)一步促進(jìn)p70S6K的磷酸化，舒芬太尼后處理通過ERK1/2介導(dǎo)的p70S6K信號(hào)通路對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。