實時熒光定量PCR檢測蔬菜病原細菌技術(shù)

陳 璐 謝學文 石延霞 李寶聚

（中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

蔬菜細菌性病害是由植物病原細菌引起的一類病害，具有侵染途徑多樣、傳播速度快、防治困難等特點，是蔬菜病害防治的重點。傳統(tǒng)的病原細菌檢測采用培養(yǎng)基分離純化與致病性鑒定的方法，隨后血清學技術(shù)的應用使得病原細菌的快速檢測成為可能（Schaad & Frederick，2002）。

Rasmussen 和Wulff 于1991年首次采用PCR 方法檢測植物病原菌（Rasmussen & Wulff，1991）及感染種子（Prosen et al.，1991），推動基于PCR 方法的植物病原菌檢測技術(shù)快速發(fā)展。20世紀90年代中期發(fā)展起來的實時熒光定量PCR 技術(shù)可以對靶標核酸進行精確定量檢測，突破了傳統(tǒng)PCR 技術(shù)只能對目標核酸進行定性檢測的局限，因而受到越來越多的重視，現(xiàn)已被廣泛應用在植物病害診斷等不同的研究領(lǐng)域。近年來，多種蔬菜病原細菌的實時熒光定量PCR檢測方法先后建立，為蔬菜病原細菌的研究和病害的防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 實時熒光定量PCR 技術(shù)原理及優(yōu)點

實時熒光定量PCR 技術(shù)的原理是在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR 進程，最后通過標準曲線和Ct值對未知模板進行定量分析的方法。常規(guī)PCR 中，擴增產(chǎn)物（擴增子）是通過終點法來分析檢測，即PCR 反應結(jié)束后，DNA 通過瓊脂糖凝膠電泳后進行成像分析（Klein，2002）。

相對常規(guī)PCR 而言，應用實時熒光定量PCR 方法檢測植物病原菌的主要優(yōu)點包括：① 實時性，實時熒光定量PCR 在反應體系中加入熒光分子，熒光信號與DNA 量的增加成對應關(guān)系，從而在反應過程中進行累積擴增產(chǎn)物的分析和檢測；② 靈敏度高，實時熒光定量PCR 有較寬的動態(tài)范圍，相較于常規(guī)PCR 而言具有較高的檢測靈敏度；③ 反應封閉，由于PCR 反應和檢測均在反應管中進行，大大降低了樣品的污染和假陽性的機率；④ 操作簡易，實時熒光定量PCR的結(jié)果無需通過瓊脂糖凝膠電泳來評估，節(jié)省了試驗時間，提高了試驗效率；⑤ 特異性強，不受植物癥狀的限制，能快速準確檢測到植物病原菌；⑥ 高處理量，自動化的PCR檢測系統(tǒng)具有較高的處理量，為大規(guī)模的植物病害診斷提供新的思路。

2 實時熒光定量PCR 在幾種重要蔬菜病原細菌檢測方面的應用

2.1 假單胞菌屬（Pseudomonas）實時熒光定量PCR檢測技術(shù)

植物病原假單胞菌（Pseudomonas）導致許多植物病害，如黃瓜細菌性角斑?。≒seudomonas syringapv.lachryman）、番茄細菌性斑點?。≒.syringaepv.tomato）、平菇褐斑?。≒.tolaasii）、萵苣軟腐?。≒.cichorii）、萵苣褐腐?。≒.marginalispv.marginalis）等（Schaad et al.，2001）。實時熒光定量PCR可用來對寄主植物組織內(nèi)潛伏侵染的病原菌或?qū)ΨN植環(huán)境中潛伏侵染的病原菌進行定量檢測。如：菊苣假單胞菌（P.cichori）對結(jié)球期的萵苣造成侵染并引起典型的軟腐病癥狀的濃度為100 cfu·mL-1，Cottyn 和Baeyen（2011）基于hrcRST致病基因片段建立了一種靈敏的實時熒光定量PCR檢測灌溉水中菊苣假單胞菌的方法，檢測灌溉水中菊苣假單胞菌的靈敏度為1 cfu·mL-1，遠遠低于該病害的發(fā)病閾值，從而為萵苣軟腐病的早期預測和預警提供信息。

多重實時熒光定量PCR 技術(shù)可以特異性檢測多種病原菌，如基于丁香假單胞菌屬（P.syringae）細胞色素氧化酶輔酶基因序列差異建立的實時熒光定量PCR 技術(shù)，可以特異檢測8種丁香假單胞菌致病變種病原菌（syringae，tomato，maculicola，tabaci，atropurpurea，phaseolicola，pisi，glycinea），檢測靈敏度為100 fg，即4.5×103cfu·mL-1，提高了檢測效率，并可以直接定量接種丁香假單胞菌番茄致病變種（P.syringaepv.tomato）的番茄離體葉片中病原菌DNA 的含量（Xu & Tambong，2011）。

2.2 黃單胞菌屬（Xanthomonas）實時熒光定量PCR檢測技術(shù)

黃單胞菌屬（Xanthomonas）是薄壁菌門的一個成員，革蘭陰性菌，該屬的細菌成員都是植物病原菌，可以危害120 多種單子葉植物和270 多種雙子葉植物，引起許多重要的植物病害，導致植物葉枯、壞死、萎蔫等癥狀；模式種是野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris），俗稱甘藍黑腐病菌。該病原菌寄主廣泛，幾乎可侵染十字花科的全部植物，引起十字花科黑腐病，葉片邊緣形成典型的V 字形黃褐色病斑，是危害十字花科植物的一種重要病原菌。相對于普通PCR，實時熒光定量PCR 的高靈敏性使得諸如十字花科黑腐病等種傳細菌性病害的研究有所突破。Berg 等（2006）建立了蕓薹屬蔬菜多種野油菜黃單胞菌（X.campestris）的致病變種（Campestris，aberrans，Armoraciae，Raphani）帶菌種子的高靈敏性實時熒光定量PCR，該方法可以檢測到10 000個種子中的1個帶菌種子，比常規(guī)PCR 靈敏度高100倍，可快速檢測以上幾種野油菜黃單胞菌的菌落、十字花科蔬菜的帶菌種子和帶菌植株中的病原菌，為種植戶和種業(yè)商戶提供防治黑腐病的可靠方法。實時熒光定量PCR 還可以通過測定寄主植物受侵染時基因的變化來研究寄主對病原菌的抗病分子機制。如在花椰菜對甘藍黑腐病菌抗病分子機制的研究中，應用實時熒光定量PCR 技術(shù)對所構(gòu)建的cDNA 文庫中相應的12個不同功能的基因表達譜進行表達量的監(jiān)測，從而得到花椰菜中參與甘藍黑腐病抗病分子機制的相關(guān)基因（Jiang et al.，2011）。

2.3 歐文氏菌屬（Erwinia）實時熒光定量PCR檢測技術(shù)

歐文氏菌屬（Erwinia）是人類最先發(fā)現(xiàn)的植物病原細菌，由歐文氏菌引起的細菌性軟腐病在世界各地都有廣泛發(fā)生和報道。主要癥狀是果實或葉片基部變軟、腐爛、伴有惡臭，可以是生長期病害，也可以是貯藏期病害。

歐文氏菌屬主要引起瓜類細菌性枯萎?。‥.tracheiphila），馬鈴薯、蘿卜、大白菜等蔬菜的軟腐?。‥.carotovara）。Atallah 和Stevenson（2006）利用實時定量PCR 技術(shù)檢測了5種馬鈴薯病原菌（E.carotovorasubsp.carotovoraand subsp.Atroseptica、Phytophthora infestans、Phytophthora erythroseptica、Pythium ultimum、Fusarium sambucinum），檢測的靈敏度達到0.5 pg，可直接從商業(yè)馬鈴薯塊莖提取液中檢測到1 ng 的馬鈴薯軟腐病菌（E.carotovora），為馬鈴薯采收后的商業(yè)貯存能力預測提供方法。

2.4 其他重要細菌性病害實時熒光定量PCR檢測技術(shù)

應用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測其他蔬菜重要病原細菌也有較多相關(guān)報道，其中研究最為深入的是瓜類細菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli）。該病原之前被命名為嗜酸菌燕麥種西瓜亞種（Acidovora avenaesubsp.Citrulli）。燕麥嗜酸菌屬病原菌的保守序列較易尋找（Schaad &Frederick，2002），故經(jīng)典的實時熒光定量PCR檢測體系基于ITS 等保守序列設(shè)計相關(guān)的PCR引物（Schaad et al.，2000）。近年來，隨著免疫學和選擇性培養(yǎng)基等富集方聯(lián)合實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測病原菌日漸成熟，定量PCR 的靈敏度得到進一步提高。應用免疫學方法，如磁珠捕獲法與實時熒光定量PCR 技術(shù)相結(jié)合，檢測瓜類果斑病菌靈敏度可達到10 cfu·mL-1，病種的檢出率為0.02%，較單一實時熒光PCR檢測的靈敏度提高了10倍（Ha et al.，2009）。利用選擇性培養(yǎng)基，如應用EBB 和EBBA 培養(yǎng)果斑病菌，結(jié)合實時熒光定量PCR 方法檢測果斑病菌，病種的檢出率為0.1%（Zhao et al.，2009），可以在一定程度上排除雜菌的影響，進一步提高檢測的靈敏性，具有較好的應用前景。

青枯病是重要的植物病原細菌，影響多種農(nóng)作物，控制青枯病重要的是早期的檢測和預防。利用免疫磁珠分離（IMS）和磁珠捕獲雜交（MCH）的方法，純化馬鈴薯青枯病菌（Ralstonia solanacearum）R3Bv2株系的細胞和DNA，與實時熒光定量PCR 技術(shù)相結(jié)合，可將實時熒光定量PCR檢測方法1 000 cfu·mL-1的檢測閾值提高到 500 cfu·mL-1（Ha et al.，2012）。Weller等（2000）首次利用實時熒光定量PCR 方法檢測馬鈴薯塊莖提取液中的青枯菌，檢測的閾值只能達到1×105～1×106cfu·mL-1。對于青枯病菌等土傳細菌性病害，實時熒光定量PCR可以直接檢測土壤樣本中的微量目標病原菌的量，而省去了病原菌的分離培養(yǎng)。Chen 等（2010）建立了單基因?qū)崟r熒光定量PCR 擴增方法，對番茄病組織和種植環(huán)境土壤中的青枯病菌直接檢測限能達到100 cfu·g-1，而采用普通PCR 方法對茄子青枯病的根圍土壤進行檢測的最低檢測閾值是400 cfu·g-1（Ramesh et al.，2011）。

番茄潰瘍病菌（Clavibacter michiganensissubsp.Michiganensis）可以在番茄種子間傳播而導致嚴重的經(jīng)濟損失。利用MCH 方法純化番茄潰瘍病病原菌核酸，解除病組織和土壤溶液中PCR 反應抑制物的影響，可以使多重實時熒光定量PCR檢測方法的靈敏度達到105cfu·mL-1（Johnson & Walcott，2012）。Cho 等（2012）建立了檢測番茄和紅辣椒上潰瘍病菌（C.michiganensissubsp.michiganensis）的定量PCR 方法，該方法可檢測到該病原菌的單克隆，靈敏性進一步提高，可應用于該病原菌低濃度帶菌種子的檢測，為該病害的潛在威脅提供預警。

3 展望

實時熒光定量PCR檢測方法快速、靈敏且特異性強，已被廣泛應用于植物細菌性、真菌性以及病毒性病原的檢測。蔬菜病原細菌多為種傳，少量甚至微量的病原菌在合適的氣候條件下能夠很快地傳播，導致嚴重的病害流行，故高靈敏性的實時熒光定量PCR 對帶菌種子的檢測技術(shù)尤為重要。隨著蔬菜產(chǎn)量的連年升高，蔬菜細菌性病害的大規(guī)模檢測也越來越受到重視，自動化的熒光PCR檢測系統(tǒng)具有較高的處理量，為多種病原菌的同時檢測提供基礎(chǔ)。另外，雖然實時熒光定量PCR 還處于初級階段，但其對于mRNA 的定量檢測有較大的潛力，可以用于病原菌與寄主間的互作或病原菌對環(huán)境變化響應的研究。同樣，實時熒光定量PCR 為單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的研究提供了可靠的方法，可用于特定病原菌基因群體的研究（Schena et al.，2004）。然而，在蔬菜病原細菌的檢測應用中，相比普通PCR 而言，其可用的熒光引物和探針仍然受到限制，且染料和探針的價格較為昂貴；而實時熒光定量PCR 最大的局限在于依然無法區(qū)分檢測材料的死活，而自然條件下的核酸酶在很多情況下不能完全降解死亡細胞。雖然選擇性培養(yǎng)基聯(lián)合實時熒光定量PCR 的方法可以定量檢測存活細胞，但其周期較長（細菌培養(yǎng)耗時1～4 d），快速有效鑒定植物病原菌死活及檢測病原菌總量的方法尚未建立。隨著技術(shù)的發(fā)展、試驗材料成本的降低以及技術(shù)之間交叉利用的快速發(fā)展，實時熒光定量PCR 在蔬菜病原細菌檢測方面將有更廣泛更深入的應用前景。

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