星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化長(zhǎng)春新堿長(zhǎng)循環(huán)納米粒的制備工藝*

封 燁，周朝陽(yáng)，劉芊芊，楊 陽(yáng)，李敏才

(1.湖北科技學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院)

長(zhǎng)春新堿(vincristine，VCR)是夾竹桃科植物長(zhǎng)春花中提取出的吲哚型生物堿，具有抗癌活性[1]，抗腫瘤較譜廣，尤其對(duì)淋巴細(xì)胞系白血病以及惡性淋巴瘤療效較好，對(duì)生殖細(xì)胞腫瘤、黑色素瘤、小細(xì)胞肺癌、尤文氏肉瘤、消化道癌及多發(fā)性骨髓瘤的治療也有良好效果[2-3]。但是其神經(jīng)系統(tǒng)毒性與劑量的累積高度相關(guān)，并且對(duì)局部組織有刺激性，這些缺陷往往限制了該藥物的使用[4]。VCR進(jìn)入體內(nèi)后其血液濃度迅速下降，而且很快分解，在體內(nèi)的分布廣泛，缺乏特異性，這些都對(duì)藥物的治療效果有很大的影響[5]。

近些年人工合成藥物載體—納米藥物遞送系統(tǒng)，以載藥率高、控釋能力好、靶向性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)被眾多研究人員關(guān)注[6-7]，尤其是聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]納米粒，由于其良好的生物相容性和生物可降解性廣泛地被用作納米遞藥系統(tǒng)的載體材料。因此，本課題選用抗癌藥物VCR，用PLGA作為載體材料，采用沉淀法制備VCR長(zhǎng)循環(huán)納米粒(VCR-NPs)，并采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)制備工藝進(jìn)一步優(yōu)化，改善該藥物的制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PLGA(75/25相對(duì)分子質(zhì)量15 000，西安瑞禧生物科技有限公司)；VCR對(duì)照品(自制)；VCR原料藥(自制)；乙腈(色譜純，美國(guó)Dikma公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)Dikma公司)；二乙胺(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

Agilen 1200型高效液相色譜儀(Agilent Technologie，UV檢測(cè)器，四元泵)；ZORBAXSB-C8柱(4.6×250mm，5μm，美國(guó)Agilent公司)；BT25S型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；3K-15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA)；X85-2S恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；PSA 1190激光粒度分析儀(安東帕上海商貿(mào)有限公司)；Hitach-7650透射電子顯微鏡(Hitachi Limited)。

1.2 方法

1.2.1 VCR-NPs制備方法[8]

精密稱(chēng)取VCR 4mg及PLGA 20mg，加入丙酮2mL溶解混合，然后滴加入 4mL水相中，邊滴加邊攪拌，并持續(xù)在室溫下攪拌1h。使有機(jī)相均勻分散在水相中，形成淡藍(lán)色乳光混懸液。將該混懸液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干，水浴溫度40℃，3000rpm、10min離心以除去沉淀，即可得到VCR-NPs混懸液。

1.2.2 HPLC分析方法建立

(1)色譜條件。參考《中國(guó)藥典》2015版[8]，色譜柱為ZORBAXSB-C8柱(4.6×250mm，5μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)為297nm；流動(dòng)相為甲醇∶二乙胺水溶液(用磷酸調(diào)pH至7.5)=70∶30；進(jìn)樣量20μL；柱溫30℃；流速1mL/min。

(2)對(duì)照品溶液的制備。稱(chēng)取VCR對(duì)照品(純度98%)適量，精密稱(chēng)定2.01mg，置于5mL容量瓶中，加入甲醇溶解稀釋并定容至刻度，搖勻，制成濃度為402μg/mL的VCR對(duì)照品溶液，作為儲(chǔ)備液。

(3)供試品溶液的制備。精密量取VCR-NPs混懸液1mL，置5mL容量瓶中，加乙腈2mL，超聲5min，使VCR-NPs溶解，加入甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)后，作為供試品溶液。

(4)專(zhuān)屬性考察。精密量取空白納米粒及VCR-NPs溶液及VCR對(duì)照品溶液各1mL，按照(3)項(xiàng)方法制備空白樣品溶液和供試品溶液。按照(1)項(xiàng)色譜條件進(jìn)行高效液相測(cè)定，記錄圖譜。

(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密量取VCR對(duì)照品儲(chǔ)備液，用流甲醇稀釋成濃度為1000、500、300、200、100、50、10μg/mL一系列溶液，按照(1)項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(6)精密度試驗(yàn)。精密吸取VCR對(duì)照品溶液，按照(1)項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD值。

(7)重復(fù)性試驗(yàn)。精密量取同一批VCR-NPs混懸液6份，按(3)項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照(1)項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算VCR含量的RSD值。

(8)穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取同一供試品溶液，在0、2、4、6、8、10、12h內(nèi)按照(1)項(xiàng)液相方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算VCR的峰面積RSD值。

(9)回收率試驗(yàn)。精密量取100μg/mL對(duì)照品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，加入空白納米粒混懸液1mL，加乙腈2mL，超聲5min，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)后，作為供試品溶液，平行制備6份，按照(1)項(xiàng)方法測(cè)定VCR含量，記錄峰面積，計(jì)算回收率及其RSD值。

(10)定量限和檢測(cè)限。精密稱(chēng)定硫酸VCR對(duì)照品適量，配制成一系列3、30、10、5、3、1ng/mL低濃度VCR對(duì)照品溶液，按(1)項(xiàng)色譜條件測(cè)定其信號(hào)。檢測(cè)限是信號(hào)值/基線噪聲值為3∶1時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度。定量限是信號(hào)值/基線噪聲值為10時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度。

1.2.3 載藥量與包封率的測(cè)定[9-10]

取適量VCR-NPs凍干粉末，用乙腈完全溶解并超聲5min進(jìn)行破碎，用超濾離心管離心，離心條件12000rpm，10min，收集下層，按1.2.2(1)項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)出藥物的總含量Wtotal；取另一份VCR-NPs凍干粉用PBS緩沖溶液(pH7.4)完全溶解，用超濾離心管離心，離心條件12000rpm，10min，收集下層溶液，按1.2.2(1)項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)出游離藥物含量Wfree。按以下公式進(jìn)行包封率及載藥量的計(jì)算：

(Wtotal：VCR納米粒中藥物總含量；Wfree：游離藥物含量；WNP：納米粒中所載的VCR和輔料量總和)

1.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化VCR-NPs的制備工藝

1.3.1 VCR-NPs處方單因素考察

根據(jù)單因素考察，選取對(duì)VCR-NPs制備影響較大的3個(gè)因素，即以VCR的用量(X1)、水相體積(X2)以及PLGA的用量(X3)作為考察對(duì)象。根據(jù)付詩(shī)瑤[9]相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)確定篩選范圍分別為X1：2～6mg，X2：2～6mL，X3：10～30mg，并以粒徑(Y1)與包封率(Y2)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)選。

1.3.2 數(shù)學(xué)模型擬合及效應(yīng)面優(yōu)化

應(yīng)用Design-ExpertV 8.0.6.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得出模型回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果以及方差分析結(jié)果，以P<0.01表示高度顯著，以P<0.05表示顯著。VCR用量(A)、水相用量(B)、PLGA用量(C)進(jìn)行模型擬合，得到粒徑及包封率的擬合方程。

1.3.3 優(yōu)化處方驗(yàn)證

根據(jù)最優(yōu)處方制備樣品計(jì)算偏差，偏差=(預(yù)測(cè)值-實(shí)際值)/預(yù)測(cè)值×100%。

1.4 VCR-NPs物理性質(zhì)考察

1.4.1 粒徑與Zeta電位測(cè)定

VCR-NPs粒徑和電位經(jīng)激光粒度分析儀測(cè)定。

1.4.2 VCR-NPs形態(tài)學(xué)觀察[11-13]

取適量VCR-NPs溶液，稀釋后，經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)，將其滴在覆蓋碳膜的100目銅網(wǎng)上，并自然干燥3min，用濾紙吸去剩余的溶液，再用2%磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染，吸去剩余的磷鎢酸溶液，在透射電子顯微鏡下觀察VCR-NPs的形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 HPLC分析方法

2.1.1 專(zhuān)屬性考察

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1(封二)。結(jié)果表明，VCR與PLGA材料分離情況良好，說(shuō)明本方法專(zhuān)屬性良好。

2.1.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為Y=16.556X-183.08，r2=0.9992，表明VCR在1000～10μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn)

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD值為0.91%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算VCR含量的RSD值為0.72%，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果VCR的峰面積RSD值為0.67%，說(shuō)明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 回收率試驗(yàn)

按照回收率試驗(yàn)方法測(cè)定VCR含量，記錄峰面積后，計(jì)算回收率為99.8%，RSD值為0.70%。

2.1.7 定量限和檢測(cè)限

檢測(cè)限是信號(hào)值/基線噪聲值為3∶1時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度。定量限是信號(hào)值/基線噪聲值為10時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度。測(cè)得最低檢測(cè)限濃度為3ng/mL，最低定量限濃度為10ng/mL。

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化VCR-NPs的制備工藝

2.2.1 VCR-NPs 處方單因素考察

篩選范圍分別為X1：2～6mg，X2：2～6mL，X3：10～30mg，并以粒徑(Y1)與包封率(Y2)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)選，各考察因素及其水平的具體取值見(jiàn)表1，應(yīng)用Design-Expert.V8.0。6.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表1 因素水平表

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

2.2.2 數(shù)學(xué)模型擬合及效應(yīng)面優(yōu)化

應(yīng)用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，模型回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3～4。方差分析結(jié)果以P<0.01表示高度顯著，以P<0.05表示顯著。VCR用量(A)、水相用量(B)、PLGA用量(C)進(jìn)行模型擬合，得到粒徑及包封率的擬合方程為：

粒徑=176.18+14.01A-11.46B+24.90C-9.28AB+14.65AC-1.00BC-27.28A2-3.98B2-10.75C2

包封率=83.31+3.72A+11.32B-3.09C-5.33AB+3.00AC-7.45BC+5.79A2-10.64B2-6.30C2

由結(jié)果可知，對(duì)于粒徑，C、A2項(xiàng)極顯著，A、B、AC項(xiàng)顯著，其他項(xiàng)不顯著，見(jiàn)表3；對(duì)于包封率，B、BC、A2、B2、C2項(xiàng)極顯著；A、C、AB、AC項(xiàng)顯著，其他項(xiàng)不顯著，見(jiàn)表 4。采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件，依據(jù)所擬合的數(shù)學(xué)模型繪制相應(yīng)效應(yīng)面圖，結(jié)果見(jiàn)圖2～7(封二)，分析每一個(gè)效應(yīng)面中考察因素的交互作用，篩選出各考察因素的最佳取值。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，并結(jié)合實(shí)際情況，最終確定VCR-NPs的制備工藝為：VCR用量4mg，水相體積4mL，PLGA 20mg。

表3 響應(yīng)面模型對(duì)粒徑的方差分析結(jié)果

表4 響應(yīng)面模型對(duì)包封率的方差分析結(jié)果

2.2.3 優(yōu)化處方驗(yàn)證

根據(jù)最優(yōu)處方制備3批樣品，平均粒徑為177.9nm、平均包封率為81.39%、平均載藥量為6.32%。計(jì)算偏差，結(jié)果見(jiàn)表5，表明測(cè)定值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)偏差較小，各項(xiàng)指標(biāo)偏差均小于±5%，說(shuō)明優(yōu)化后的處方驗(yàn)證試驗(yàn)所測(cè)出的粒徑、包封率的測(cè)定值與預(yù)測(cè)值基本一致，工藝重復(fù)性好，證明星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法有良好的預(yù)測(cè)效果，制備工藝可行。

表5 比較模型預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)測(cè)定值

2.3 VCR-NPs物理性質(zhì)考察

2.3.1 粒徑與Zeta電位測(cè)定

VCR-NPs粒徑和電位經(jīng)激光粒度分析儀測(cè)定，其平均粒徑為177.9nm，分散指數(shù)(PDI)為0.12，粒徑呈正態(tài)分布，Zeta電位為-30.7mV，說(shuō)明所制備的納米粒具有良好的穩(wěn)定性和分散性。結(jié)果見(jiàn)圖8～9。

圖8 VCR-NPs粒徑分布

圖9 VCR-NPs的Zeta電勢(shì)圖

2.3.2 VCR-NPs形態(tài)學(xué)觀察

電子顯微鏡下觀察VCR-NPs的形態(tài)，結(jié)果可見(jiàn)VCR-NPs呈現(xiàn)類(lèi)圓球形。見(jiàn)圖10。

圖10 VCR-NPs透射電鏡掃描圖片(×30000)

3 討 論

目前癌癥已成為人類(lèi)全球第一位的致死病因，而化療是現(xiàn)如今治療惡性腫瘤的主要方式，但是化學(xué)藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞同樣具有毒性作用，從而對(duì)組織器官造成不可逆的損傷[14]?，F(xiàn)如今可用于臨床治療惡性腫瘤的化療藥物超過(guò)40種，因此，改良藥物劑型，提高化學(xué)藥物的治療靶向性，已成為藥學(xué)研究人員的重要課題[15]。納米載體具有毒性低、可生物降解、生物相容性良好等優(yōu)勢(shì)被廣泛用于化療藥物載體的研究開(kāi)發(fā)。

VCR是已上市化療一線用藥，臨床應(yīng)用會(huì)引起低鈉血癥、神經(jīng)毒性等毒副作用[16-17]。本研究通過(guò)納米沉淀法制備了VCR-NPs，該方法操作簡(jiǎn)單，實(shí)際應(yīng)用性強(qiáng)，故采用此法。并通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)該制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)數(shù)據(jù)擬合，繪制三維效應(yīng)面，從而在控制納米粒粒徑的同時(shí)提高藥物包封率，預(yù)測(cè)出最優(yōu)值，得到最佳制備工藝為VCR 4mg，PLGA 20mg，加入丙酮2mL溶解混合后，滴加到4mL水相中，持續(xù)在室溫下攪拌1h后，將該混懸液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，水浴溫度40℃將丙酮揮干即可。經(jīng)優(yōu)化后VCR-NPs平均粒徑為177.9nm，平均包封率為81.39%，平均載藥量為6.32%，Zeta電位為-30.7mV，具有良好的穩(wěn)定性和分散性。在驗(yàn)證試驗(yàn)中各指標(biāo)平均實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值的偏差<5%，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確可靠，且重現(xiàn)性良好，為VCR-NPs的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。