無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷方法研究進(jìn)展

曾 婷綜述 熊禮寬審校

深圳市寶安區(qū)婦幼保健院中心實(shí)驗(yàn)室(518133)

產(chǎn)前診斷又稱宮內(nèi)診斷，是指在胎兒出生前，通過影像學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等技術(shù)，了解胎兒宮內(nèi)的發(fā)育狀態(tài)，對先天性缺陷或遺傳性疾病作出診斷。產(chǎn)前診斷是預(yù)防嚴(yán)重遺傳性疾病或先天性缺陷胎兒出生的一項(xiàng)有效而可靠的措施，是優(yōu)生和提高人口質(zhì)量的重要保障之一。產(chǎn)前診斷方法根據(jù)采樣途徑或診斷方法是否構(gòu)成對胎兒的影響可分為創(chuàng)傷性和無創(chuàng)性。前者主要包括羊膜腔穿刺、絨毛取樣、臍血取樣、胎兒鏡和胚胎活檢等，雖然診斷精確度較高，但可導(dǎo)致流產(chǎn)或感染等并發(fā)癥，常在高危孕婦中實(shí)施;后者包括超聲波檢查、直接從母體外周血中獲取胎兒細(xì)胞、胎兒游離DNA［1］或游離RNA檢測，該法既能行產(chǎn)前診斷又無危險(xiǎn)性，盡早發(fā)現(xiàn)和杜絕異常胎兒，亦適用于大群體篩查，達(dá)到優(yōu)生目的。近年來，胎兒游離核酸和有核細(xì)胞結(jié)合基因檢測取得較大進(jìn)展，本文就無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷的研究材料、方法學(xué)及其產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的研究材料

1.1 孕婦外周血中循環(huán)的胎兒細(xì)胞

許多研究表明，循環(huán)于孕婦外周血中的胎兒細(xì)胞主要有胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞、胎兒淋巴細(xì)胞和胎兒有核紅細(xì)胞。由于滋養(yǎng)層細(xì)胞存在胎盤局限性嵌合體現(xiàn)象，胎兒淋巴細(xì)胞可在生產(chǎn)后的母體外周血中存活達(dá)27年之久，因此，極大地限制了這兩類細(xì)胞用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的應(yīng)用。近年來，許多研究集中在胎兒的有核紅細(xì)胞方面，被認(rèn)為是最佳的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞來源。其主要優(yōu)勢有:①含有完整的胎兒基因組DNA;②細(xì)胞生命周期短，不受多次妊娠干擾;③健康非孕婦的外周血中十分罕見;④可根據(jù)特異的細(xì)胞標(biāo)志物，如 HbF(γ 鏈)、CD71［2］等區(qū)別于母體外周血中的其他細(xì)胞。

目前常用于從孕婦外周血中分離富集胎兒有核紅細(xì)胞的方法有:流式細(xì)胞儀分離技術(shù)、磁激活細(xì)胞分選法、密度梯度離心法、單細(xì)胞顯微操作分離法、親和素分離法、微流控制分離法等［3］。

1.2 孕婦外周血中存在的胎兒游離DNA(cff DNA)

1997年，Lo等［1］發(fā)現(xiàn)母體外周血漿中存在cff DNA，隨孕齡增長穩(wěn)定存在，在孕婦分娩后快速消失，可以作為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的理想材料。由于cff DNA在母體外周血漿總DNA中所占比例較低(3%～6%)，cff DNA的提取純化方法尤為關(guān)鍵。2004年，Chan等［4］研究發(fā)現(xiàn)，非孕婦的外周血漿中的游離DNA分子片段長度比孕婦DNA短。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胎兒的游離DNA分子片段長度＜313 bp，其中80%不足193 bp，而其母體的游離DNA分子片段長度＞201 bp，這個(gè)現(xiàn)象為分離cff DNA提供了保證。cff DNA可結(jié)合二代測序應(yīng)用于臨床篩查21三體、18三體和13三體綜合征。雖然目前cff DNA的提取純化方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化，但其用于篩查的敏感性和特異性明顯高于生化標(biāo)記物，包括母體血清妊娠相關(guān)蛋白A(PAPP-A)、游離β絨毛膜促性腺激素(β -hCG)、甲胎蛋白(AFP)、游離雌三醇(μE3)和抑制素A(inhibin A)。目前常用的鑒定cff DNA的技術(shù)有:實(shí)時(shí)定量 PCR［5］、巢式 PCR、焦磷酸解激活的聚合 PCR［6］、數(shù)字化 PCR［7］以及質(zhì)譜分析。

1.3 孕婦外周血中存在的胎兒游離miRNA

miRNA為一類單鏈非編碼小分子RNA，長度約為19～25個(gè)核苷酸，在基因轉(zhuǎn)錄后，通過與靶mRNA相結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或降解mRNA，從而達(dá)到對人類基因表達(dá)的調(diào)控作用。2008年Chim等［8］發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中存在胎盤游離miRNA，分娩24h后即檢測不到表達(dá)。一些miRNA如miR141和miR149的表達(dá)量可隨孕齡增長而升高，且與胎盤的大小相關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在孕婦外周血中存在許多與胎兒相關(guān)的miRNA［9］，可用于胎兒診斷，為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究開辟了另一途徑。

2 基因診斷方法在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

2.1 全基因組擴(kuò)增技術(shù)(WGA)

WGA是一種對全部基因組序列進(jìn)行非選擇性、均勻擴(kuò)增的技術(shù)，可以在保持基因組原貌的基礎(chǔ)上最大限度地增加基因組DNA的量。該技術(shù)可對痕量DNA(檢測靈敏度可達(dá)5pg)進(jìn)行擴(kuò)增，為后續(xù)的基因組分析提供足量的模板。常用的WGA主要分兩類:一類是以PCR為基礎(chǔ)，如使用變性寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、引物延伸預(yù)擴(kuò)增PCR(PEP-PCR);另一類是不以PCR為基礎(chǔ)，如多重置換擴(kuò)增(MDA)。由于以PCR為基礎(chǔ)的WGA易產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增，位點(diǎn)覆蓋率不完全，且DNA片段長度一般小于1kb，使其應(yīng)用受到限制［10］。

MDA的出現(xiàn)，使真正意義的全基因組擴(kuò)增得以實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)能提供高度均一完整的全基因組序列，確保最低的位點(diǎn)擴(kuò)增誤差，使產(chǎn)物與模板的遺傳序列信息保持一致。MDA是一種等溫的鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，其使用隨機(jī)6個(gè)堿基引物在多位點(diǎn)與模板結(jié)合，采用很強(qiáng)的模板結(jié)合和置換能力的phi29DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)對全基因組的擴(kuò)增。MDA具有如下優(yōu)點(diǎn):①能產(chǎn)生大量高質(zhì)量的DNA產(chǎn)物;②能擴(kuò)增出集中均一的長片段產(chǎn)物，便于后續(xù)分析;③能使基因組DNA均勻擴(kuò)增，且擴(kuò)增偏差小。由于MDA能高保真地復(fù)制全基因序列，使得體外擴(kuò)增胎兒有核紅細(xì)胞基因組成為可能。2007年，劉維瑜等［11］用顯微操作法獲取孕婦外周血循環(huán)的單個(gè)胎兒有核紅細(xì)胞后，進(jìn)行MDA，得到的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物直接作為模板進(jìn)行性別鑒定及短串聯(lián)重復(fù)序列連鎖分析檢測，驗(yàn)證有核紅細(xì)胞的來源，同時(shí)進(jìn)行杜氏肌營養(yǎng)不良的無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷，診斷結(jié)果與引產(chǎn)或產(chǎn)后反饋相一致。今后，結(jié)合MDA技術(shù)，將會加快孕婦外周血中循環(huán)的胎兒有核紅細(xì)胞在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷應(yīng)用的腳步。

2.2 比較基因組雜交(CGH)

該技術(shù)基本原理是分別用不同的熒光標(biāo)記體系標(biāo)記來自待檢組織和正常組織的全基因組DNA(分別稱為測試DNA和參照DNA)，各取等量標(biāo)記產(chǎn)物制備成混合探針，與足夠量的同一種屬來源的Cot.I DNA先進(jìn)行預(yù)雜交以封閉基因組上的重復(fù)序列，然后與正常中期分裂相進(jìn)行染色體原位雜交。測試DNA探針和參照DNA探針競爭性地與染色體上的靶序列雜交，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件分析，將染色體上每一像素上測試DNA/參照DNA熒光強(qiáng)度的差異進(jìn)行計(jì)算，以研究測試DNA拷貝數(shù)的增多或缺失。該技術(shù)不需細(xì)胞培養(yǎng)，一次雜交實(shí)驗(yàn)即可在整條染色體或染色體區(qū)帶水平對不同基因組間DNA序列拷貝數(shù)的差異進(jìn)行檢測并定位。為了解決傳統(tǒng)的CGH雜交時(shí)間太長，研究人員將基因芯片和CGH結(jié)合，形成新技術(shù)-微陣列比較基因組雜交技術(shù)(microarray-CGH，又稱arrayCGH)。其原理與CGH相似，不同之處是用微陣列(即基因芯片)代替了中期分裂相，熒光標(biāo)記的測試DNA探針和參照DNA探針競爭性地與微陣列中的短片段靶序列雜交，這樣就縮短了檢測時(shí)間，達(dá)到靈敏、快速、自動化，在臨床遺傳學(xué)診斷中有較好的應(yīng)用前景。

比較傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)，arrayCGH技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于可檢測基因組上的微缺失和微重復(fù)。而且由于不需要細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞分離，可直接取材于羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞或臍血。Hillman等［12］為了評價(jià)arrayCGH在微觀基因組失衡的產(chǎn)前篩查臨床價(jià)值，特設(shè)計(jì)了一組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，2008～2011年，共收集了3 171份胚胎均進(jìn)行過產(chǎn)前arrayCGH檢測和傳統(tǒng)染色體核型分析檢測，結(jié)果顯示arrayCGH方法檢測微觀基因組失衡是有效的。

在個(gè)案研究中，研究人員利用arrayCGH發(fā)現(xiàn)了許多新缺失，如帶有12q22q23.2間隙式缺失的畸形胚胎［13］、新12p-三體綜合征［14］以及帶有15 q15.3-q21.3間隙式缺失的短股骨分離畸形胚胎［15］。Gruchy等［16］收集了38例高危孕婦(其中某些存在胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和/或胎兒畸形)已細(xì)胞培養(yǎng)過的羊水細(xì)胞DNA和羊水cff DNA進(jìn)行arrayCGH診斷，結(jié)果顯示直接提取于羊水的cff DNA得到了很好的結(jié)果(8%的畸形確診率，同時(shí)也經(jīng)傳統(tǒng)核型分析驗(yàn)證過)。已培養(yǎng)的羊水細(xì)胞DNA，直接提取cff DNA的優(yōu)勢在于可在妊娠晚期進(jìn)行，而羊水細(xì)胞培養(yǎng)則不行。

2.3 二代測序技術(shù)(NGS)

NGS為新一代測序技術(shù)［17～19］，其主要原理是:①每個(gè)位點(diǎn)以單分子原DNA模板合成新DNA同時(shí)測序，在此過程中添加不同種dNTP會釋放出不同的熒光;②巨大數(shù)量位點(diǎn)上各DNA短片段測序以陣列方式同時(shí)平行進(jìn)行。通過測定每種分子序列的頻率定量地反應(yīng)其在原DNA庫中的頻率，同時(shí)測出的序列準(zhǔn)確、定性地反應(yīng)其在原DNA庫中的序列，如有背景信號造成序列不符很容易在結(jié)果中濾除。這一測序技術(shù)不僅保持了高準(zhǔn)確度，而且在明顯提高測序速度，同時(shí)極大降低了測序成本，為未來更全面、更深入地對疾病進(jìn)行研究提供平臺，使得從基因組水平、轉(zhuǎn)錄組水平和蛋白質(zhì)組水平對疾病展開全方位研究成為可能。

由于二代高通量測序的高效性及高準(zhǔn)確率，研究人員將其作為無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)，直接取材于孕婦外周血中存在的cff DNA，應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體的臨床檢測。Chiu等人［20］提取了753例孕婦的外周血cff核酸，并用二代測序技術(shù)進(jìn)行測序，準(zhǔn)確診斷出86例孕婦懷有21三體的胎兒。21三體的陽性預(yù)測率為96.6%，陰性預(yù)測率為100%，靈敏度達(dá)到100%，特異性達(dá)到97.9%。Palomaki等［21］用染色體核型分析方法和二代測序方法分別對212例已證實(shí)懷有21三體胎兒的孕婦和1 484例正常孕婦進(jìn)行cff核酸檢測。結(jié)果顯示，21三體的檢出率為98.6%，假陽性率僅為0.2%。除了檢測21三體以外，這項(xiàng)技術(shù)還可用于鑒定18三體和13 三體，檢出率高達(dá)100%和91.7%［22］。Dan等［23］募集到11 105例孕婦，利用二代測序進(jìn)行了胎兒21三體和18三體綜合征的檢測，結(jié)果共檢測出190例(1.17%)染色體數(shù)目異常患者，包括143例21三體綜合征患者以及47例18三體綜合征患者。通過對陽性結(jié)果進(jìn)行核型分析以及胎兒出生后的隨訪，研究人員發(fā)現(xiàn)所檢測出的21三體和18三體綜合征病例中均有一例假陽性;而在對所有的陰性病例及胎兒出生后的隨訪中發(fā)現(xiàn)沒有出現(xiàn)假陰性。因此，本次臨床結(jié)果顯示二代測序無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)的敏感度達(dá)到100%，準(zhǔn)確度達(dá)到99.96%。

3 展望

綜上所述，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展與完善，使得從孕婦外周血中分離并檢測胎兒細(xì)胞和cff核酸成為可能。目前雖然有些分離胎兒細(xì)胞的方法相對簡便，但由于其分離效率低使得應(yīng)用受限制，將來若能結(jié)合WGA，以獲得大量高質(zhì)量的DNA產(chǎn)物，這一問題將得以解決。由于孕婦外周血中cff核酸受母體核酸物質(zhì)的干擾，檢測技術(shù)難度大，其應(yīng)用受到限制。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，利用母親與胎兒的DNA甲基化的差異性，例如18號染色體上的mapsin基因、3號染色體上的rassf1a基因、21號染色體上的 aire、erg和 hlcs基因［24］以及DSCR4基因［25］就可區(qū)分母體核酸，排除其干擾。目前無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)相對較復(fù)雜，且成本高，在現(xiàn)有技術(shù)水平上難以大范圍應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷。隨著科學(xué)的發(fā)展，會使這些技術(shù)操作簡化、標(biāo)準(zhǔn)化，提高診斷準(zhǔn)確率，降低成本?？傊?，無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷替代傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷是未來發(fā)展的必然趨勢。

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