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    人參皂苷Rb2在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為及代謝產(chǎn)物研究

    2017-03-02 19:22張喆滕亞然呂子燕吳巍劉淑瑩
    分析化學(xué) 2017年2期
    關(guān)鍵詞:皂苷產(chǎn)物甲醇

    張喆 滕亞然 呂子燕 吳巍 劉淑瑩

    摘要建立快速高分離度液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用方法(RRLCQTOFMS), 分析人參皂苷Rb2在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為, 并探索人參皂苷Rb2在大鼠體內(nèi)的代謝過程。采用Agilent SBC18色譜柱, 流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液, B為乙腈, 流速為0.2 mL/min, 進(jìn)樣量為5 μL, 二元線性梯度洗脫分離, 采用電噴霧負(fù)離子模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測。方法的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分別為0.08 μg/mL和0.1 μg/mL, 線性范圍為0.10~1.26 μg/mL。結(jié)果表明, 人參皂苷Rb2靜脈注射后的體內(nèi)代謝過程符合二室模型特征, 血藥濃度半衰期的α相(t1/2α)和β相(t1/2β)分別為(23.58±1.10)和(1306.55±147.23) min。 通過對靜脈注射人參皂苷Rb2的大鼠尿液和口服后的糞便樣本進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)Rb2的代謝產(chǎn)物為M6, M2(CY), F2, CK。

    關(guān)鍵詞人參皂苷Rb2; 藥代動(dòng)力學(xué); 代謝產(chǎn)物; 液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜

    1引 言

    人參皂苷Rb2為人參(Panax ginseng C. A. Mey.)的主要活性成分之一, 含量約為6.7 mg/g[1]。研究表明, 人參皂苷Rb2能抑制地塞米松引起的細(xì)胞凋亡作用[2], 對于小鼠在輻照誘導(dǎo)的造血系統(tǒng)損傷具有保護(hù)作用[3]。人參皂苷Rb2能夠降低在高膽固醇或脂肪酸培養(yǎng)下的3T3L1脂肪細(xì)胞的膽固醇和三酰甘油的含量[4]。另外, 人參皂苷Rb2對物質(zhì)代謝亦有一定的影響, 能夠通過AMPK介導(dǎo)抑制糖原異生作用[5]; 能明顯增加大鼠骨髓細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)的合成, 促進(jìn)血清蛋白質(zhì)合成等活性[6~10]。人參皂苷在胃腸道中和酸性條件下會(huì)產(chǎn)生多種代謝和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物, 包括人參皂苷Rg3和CK等具有活性的化合物[11~13]。因此人參皂苷的藥代動(dòng)力學(xué)、生物和化學(xué)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物研究也一直備受關(guān)注, 對于揭示人參皂苷的藥理作用和物質(zhì)基礎(chǔ)有重要意義, 并且直接影響人參的開發(fā)應(yīng)用。Karikura等[14,15]對于人參皂苷Rb2在大鼠大腸和胃中的代謝情況進(jìn)行了研究, 鑒定了氧化和去糖基化代謝產(chǎn)物。有文獻(xiàn)針對口服后復(fù)方中人參皂苷Rb1、柚皮苷和人參皂苷Rb2進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)研究[16]。但對于人參皂苷Rb2單體的大鼠體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)和代謝產(chǎn)物未見報(bào)道。為了獲得人參皂苷Rb2在生物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù), 更好地理解其在生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化和排泄途徑, 本研究將利用RRLCQTOF MS聯(lián)用技術(shù)對大鼠靜脈注射和口服人參皂苷Rb2后的血漿、尿液、糞便進(jìn)行檢測, 計(jì)算靜脈注射后相關(guān)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并分析鑒定其代謝產(chǎn)物。為深入研究開發(fā)人參皂苷Rb2提供理論基礎(chǔ), 對進(jìn)一步闡明人參皂苷Rb2的生物活性提供依據(jù)。

    2實(shí)驗(yàn)部分

    2.1儀器與試劑

    6520RRLCQTOF質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司); 5804R臺式高速大容量冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司); ULT13863V41超低溫冰箱(美國Thermo公司); 超純水機(jī)(美國Millipore公司)。人參皂苷Rb2, Rf, F2, CK固體對照品(吉林大學(xué), 純度95%); 甲醇、乙腈和甲酸(色譜純, 美國TEDIA公司); Wistar大鼠(體重(200 ± 10)g, 雄性, 購自吉林大學(xué))。

    2.2實(shí)驗(yàn)條件

    2.2.1色譜條件Agilent SBC18色譜柱(100 mm× 3.0 mm, 1.8 μm, 600 bar), 柱溫25℃; 采用二元線性梯度洗脫: 流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液, B為乙腈。梯度洗脫: 0~13 min, 25%~46% B; 13~19 min, 46%~50% B; 19~22 min, 50%~90% B; 22~25 min, 90% B。進(jìn)樣量為5 μL。

    2.2.2質(zhì)譜條件采用電噴霧負(fù)離子模式; 質(zhì)量掃描范圍m/z 100~2200; 干燥氣流速(N2)為8.0 L/min; 干燥氣溫度為350℃; 霧化氣壓力為255 kPa; 碰撞電壓為3500 V, 裂解電壓為175 V, 錐孔電壓65 V。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用安捷倫Masshunter軟件(B.03.01版本)進(jìn)行分析。

    2.3樣品的配制及樣品處理

    以甲醇為溶劑將Rb2和Rf(內(nèi)標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)品分別配制為100和10 μg/mL的對照品母液。4℃冷藏備用, 實(shí)驗(yàn)時(shí)用甲醇稀釋。將不同濃度的Rb2對照品母液和Rf工作液各100 μL, 加入100 μL 空白大鼠血漿中混勻, 再加入200 μL甲醇, 渦旋1 min沉淀血漿中蛋白, 離心5 min, 取上清放入另一試管中, 最終配制成相當(dāng)于Rb2濃度為0.08, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0和1.3 μg/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)液。

    2.4實(shí)驗(yàn)方法

    選取6只大鼠分別用于Rb2靜脈注射給藥, 給藥方式為尾靜脈注射, 給藥劑量為2mg/kg。分別于給藥前(0時(shí))和給藥后2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60和90 min和2, 4, 6, 8, 12及24 h目內(nèi)眥取血, 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血0.5 mL, 血液冷卻后3000 r/min離心10 min, 取上清血漿100 μL, 測定前加入100 μL Rf內(nèi)標(biāo)液和300 μL甲醇, 渦旋30 s, 靜置5 min, 離心10 min。取上清液, 裝瓶, 待測。

    選取6只大鼠, 隨機(jī)分為Rb2靜脈注射組和口服組, 每組3只, 靜脈注射劑量為2 mg/kg, 口服劑量為50 mg/kg, 制備方法同上。以上動(dòng)物給藥后均放入代謝籠中收集尿液(0~24 h)和糞便(0~24 h), 尿液樣本收集后, 經(jīng)氮?dú)獯蹈蓾饪s, 水飽和正丁醇萃取, 萃取液再用氮?dú)獯蹈桑?經(jīng)過80%甲醇提取后, 用0.45 μm微孔濾膜過濾, 最后用80%甲醇定容至1 mL, 待測; 糞便樣本收集后進(jìn)行研磨粉碎, 加入50 mL水溶解, 再用100 mL水飽和正丁醇分3次萃取, 萃取液放置蒸發(fā)皿中, 置水浴鍋上蒸干, 然后用80%甲醇溶解并定容至1 mL, 待測。

    3結(jié)果與討論

    3.1RRLCQTOFMS和MS/MS方法的優(yōu)化

    利用人參皂苷Rb2進(jìn)行RRLCQTOFMS和MS/MS的檢測方法優(yōu)化。Rb2是二醇型人參皂苷(圖1), 在苷元的C3位和C20位分別為葡萄糖葡萄糖和葡萄糖阿拉伯糖取代。分別在RRLCQTOFMS正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行測定。測定的準(zhǔn)分子離子和碎片離子的誤差小于10 ppm(圖2A), 在下文中討論的離子的m/z數(shù)值均用整數(shù)表示。在0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相的條件下, Rb2在負(fù)離子模式下分別給出[M-H]

    3.2方法學(xué)考察

    3.2.1專屬性通過比較空白與加入Rb2和內(nèi)標(biāo)的血漿樣本的LCMS色譜考察本實(shí)驗(yàn)的專屬性。人參皂苷Rb2和內(nèi)標(biāo)Rf的選擇性良好, 生物基質(zhì)的干擾較小, Rb2和內(nèi)標(biāo)Rf的保留時(shí)間分別為10.08 min和10.57 min。

    3.2.2線性關(guān)系用Rb2/內(nèi)標(biāo)Rf的峰面積比值(Y)與Rb2含量(X)進(jìn)行最小二乘線性回歸, 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=3.5174X+0.117, R2=0.9937。結(jié)果顯示在0.10~1.26 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分別為0.08和0.10 μg/mL。

    3.2.3精密度與準(zhǔn)確度采用高、中、低3個(gè)濃度的Rb2血漿QC樣本, 每個(gè)濃度進(jìn)行6個(gè)樣本分析, 連續(xù)測定3天。計(jì)算日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度。日內(nèi)和日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差別(RSD)均小于5%, 表明本方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

    3.2.4提取回收率分別取Rb2高、中、低3個(gè)濃度的QC樣本, 將空白血漿中先加入Rb2, 處理后計(jì)算所測得峰面積, 與空白血漿處理后加入相同量Rb2所測得峰面積比值的百分率進(jìn)行比較, 考察樣品的提取回收率。結(jié)果表明, Rb2提取回收率范圍為92.6%~93.4%, RSD小于15%。

    4結(jié) 論

    本研究建立了人參皂苷Rb2的RRLCQTOFMS 和MS/MS藥代動(dòng)力學(xué)和代謝產(chǎn)物研究方法。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明人參皂苷Rb2體內(nèi)分布代謝符合二室模型, 血藥濃度半衰期的α相(t1/2α)和β相(t1/2β)分別為(23.576±1.103)min和(1306.545±147.226)min, 在體內(nèi)有較高的血漿蛋白結(jié)合率。α相分布較快, 而β相的消除較緩慢。運(yùn)用優(yōu)化后的RRLCQTOFMS/MS方法, 對靜脈注射和口服后人參皂苷Rb2的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明, 去糖基化是人參皂苷Rb2在大鼠體內(nèi)主要的代謝方式。鑒定了代謝產(chǎn)物M6、M2(CY)、F2和CK, 總結(jié)了大鼠在靜脈注射和口服給藥后Rb2尿液和糞便的代謝路徑, 分別為Rb2M6M2和Rb2M6M2(CY)/F2CK代謝途徑。人參皂苷Rb2的藥代動(dòng)力學(xué)研究和體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化研究結(jié)果為更好地理解和開發(fā)人參皂苷Rb2的應(yīng)用價(jià)值提供了理論基礎(chǔ)。

    AbstractA rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupoletimeofflight mass spectrometric (RRLCQTOFMS) method was established and optimized for the analysis of pharmacokinetic behavior of ginsenoside Rb2 in rats by intravenous injection administration. The metabolism of ginsenosides Rb2 in vivo rat was also explored. In the experiment, Agilent SB C18 column was selected for the sample separation with 0.1% aqueous formic acid solution as mobile phase (A) and acetonitrile as mobile phase (B) at a flow rate of 0.2 mL/min, and the injection volume was set to 5 μL. QTOFMS was carried out in electron pray ionization (ESI) negative ion mode. The limit of quantification (LOQ, S/N=10) and limit of detection (LOD, S/N=3) were 0.10 and 0.08 μg/mL, respectively, and the linear range was 0.1-1.26 μg/mL. The experiment results showed that the concentrationtime profile of ginsenoside Rb2 conformed to a twocompartment pharmacokinetic model after intravenous administration for rats. The mean plasma elimination halflives were (23.58±1.10) min (t1/2α), (1306.55±147.23) min (t1/2β) for Rb2. By analyzing the urine of rats after intravenous administration and the fecal samples after oral administration of ginsenoside Rb2, it was found that the metabolites were M6, M2(CY), F2, and CK.

    KeywordsGinsenoside Rb2; Pharmacokinetics; Metabolite; Rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupoletimeofflight mass spectrometry

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