白花樹組織培養(yǎng)技術(shù)研究

張亮亮，柳新紅，林新春，李因剛，石從廣，劉伊里，何云核*

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；2. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；3. 浙江省青田縣林業(yè)局，浙江 青田 323900）

白花樹組織培養(yǎng)技術(shù)研究

張亮亮1,2，柳新紅2，林新春1，李因剛2，石從廣2，劉伊里3，何云核1*

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；2. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；3. 浙江省青田縣林業(yè)局，浙江 青田 323900）

以白花樹種子為材料，對(duì)其進(jìn)行試管繁殖研究。結(jié)果表明：將種子切除胚乳，只保留胚接種于培養(yǎng)基，可比未切除胚乳的提前長(zhǎng)出子葉，并能降低污染率，提高成活率，污染率和成活率分別為11 %和82 %；以MS＋0.3 mg/L BA為增殖培養(yǎng)基，增殖效果最佳，增殖系數(shù)達(dá)到5.7，芽長(zhǎng)為4.46 cm，芽多且粗壯；采用兩階段誘導(dǎo)白花樹生根，以100 mg/L IBA處理3 d為最佳，生根率達(dá)到60%。

白花樹；組織培養(yǎng)；快速繁殖

白花樹（Styrax tonkinensis）又名越南安息香，俗稱東京野茉莉，屬安息香科安息香屬落葉喬木，主要分布于熱帶亞熱帶地區(qū)海拔100 ~ 2 000 m的山坡、疏林中或林緣，在我國(guó)天然分布于云南、貴州、廣西、廣東、福建、湖南、江西和浙江等省區(qū)[1~2]，其中，浙江為其分布的新記錄種[2]。該樹種能耐貧瘠和干旱，具很強(qiáng)的萌芽更新能力[3]；早期速生，在浙江云和、遂昌和龍泉人工林優(yōu)選試驗(yàn)中，4年生白花樹的胸徑、樹高和材積等性狀均顯著高于本地對(duì)照的鄉(xiāng)土樹種[4]；木材為散孔材，樹干通直，結(jié)構(gòu)致密，材質(zhì)松軟，可作火柴桿、家具及板材[1]；種子油稱“白花油”，可供藥用，也可制備生物柴油性能，是一種比較理想的0#柴油替代品[5]；樹脂稱“安息香”，含較多香脂酸，是醫(yī)藥上貴重藥材，并可制造高級(jí)香料[1]；花潔白下垂，清香美麗，是優(yōu)良的園林觀賞樹種[6]；白花樹樹種優(yōu)良，集油用、材用、藥用和觀賞于一身，目前有關(guān)其種子繁殖技術(shù)的報(bào)道也較多[7~11]，但缺少對(duì)其快繁技術(shù)的研究。本研究旨在對(duì)白花樹的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究，為這一優(yōu)良樹種的種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白花樹種子為浙江省林業(yè)科學(xué)研究院苗圃當(dāng)年采集，種源地江西吉水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌培養(yǎng)體系的建立

1.2.1.1 材料處理 剝?nèi)シN子的外殼，將種仁放于燒杯中，蓋上紗布，用自來(lái)水沖洗 12 h。倒出自來(lái)水后，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，以5.0 g/L次氯酸鈉溶液（每50 mL加1滴吐溫-20）真空抽濾消毒15 min，再用無(wú)菌水沖洗5次，最后將材料分為2組，A組為未切除胚乳，保留整個(gè)種仁，B組為切除胚乳，只留下胚，分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每組處理100管，接種后，放于培養(yǎng)室暗柜，2 d后拿出。

1.2.1.2 培養(yǎng)條件 置于溫度（25±2）℃、每天光照/黑暗為16/8 h、光強(qiáng)為2 500 ~ 2 800 lx的培養(yǎng)室中。

1.2.1.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS＋30 g/L蔗糖＋2.5 g/L固化劑（Gelrite），滅菌前調(diào)pH值5.7，誘導(dǎo)種子萌發(fā)。培養(yǎng)6周后調(diào)查并統(tǒng)計(jì)外植體的污染率和成活率。

1.2.2 不同質(zhì)量濃度BA和NAA組合增殖試驗(yàn) 以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入BA、NAA兩種生長(zhǎng)激素。研究BA（0、0.3、1、3 mg/L）與NAA（0、0.3、1、3 mg/L）不同組合對(duì)芽增殖和植株生長(zhǎng)的影響[13]。選取1 ~ 2 cm的芽作為外植體，接種到上述培養(yǎng)基中。培養(yǎng)6周后觀察和統(tǒng)計(jì)外植體增殖狀況。

1.2.3 兩階段生根試驗(yàn) 第一階段分別用100、300 mg/L的IBA處理不同天數(shù)（0、3、7、10、14 d）；第二階段轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)基[14]。選取1 ~ 2 cm的芽作為外植體，接種到上述培養(yǎng)基中。每種處理10管，培養(yǎng)6周后調(diào)查和統(tǒng)計(jì)外植體生根狀況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)初步統(tǒng)計(jì)分析均采用Microsoft Excel 2003處理，方差分析和多重比較分析采用SPSS 13.0處理。

褐化程度中0表示無(wú)褐化，1表示輕微褐化，2表示中度褐化，3表示深度褐化，4表示褐化死亡。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌培養(yǎng)體系的建立

白花樹種子的千粒重為 184 g，外有一層硬殼，難剝?nèi)?。種子含有胚乳，不易切除，給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)了巨大的障礙，需要在操作時(shí)極為小心，不能傷到胚。結(jié)果表明：接種切除胚乳的胚，可將污染率控制在11%左右，成活率較高，達(dá)到82%，且生長(zhǎng)較快，7 d后就長(zhǎng)出兩片子葉；而接種沒有切除胚乳的胚，在試管培育中，子葉從胚乳長(zhǎng)出的階段要多花約2周的時(shí)間，21 d后才長(zhǎng)出子葉，有明顯的差異（表1）。說(shuō)明切除胚乳可以降低外植體的污染率，提高成活率，縮短生長(zhǎng)周期，利于獲得無(wú)菌材料。

2.2 不同生長(zhǎng)激素對(duì)芽增殖的影響

采用BA 4個(gè)質(zhì)量濃度（0、0.3、1、3 mg/L）與NAA 4個(gè)質(zhì)量濃度（0、0.3、1、3 mg/L），共16個(gè)組合的處理，如表2。由表2可知，當(dāng)BA的質(zhì)量濃度一定，隨著NAA質(zhì)量濃度的增大，增殖系數(shù)呈遞減趨勢(shì)，芽長(zhǎng)也逐漸變短，當(dāng)培養(yǎng)基為MS＋BA 0.3mg/L＋NAA 0 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)為5.7，芽長(zhǎng)為4.46 cm，為16組數(shù)據(jù)中最大，說(shuō)明在一定BA的濃度下，添加NAA不利于芽的生長(zhǎng)，濃度越大，植株變的越矮，愈傷組織增多，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重；當(dāng)NAA的質(zhì)量濃度一定，隨著BA的增加，增殖系數(shù)先增大后減小，芽長(zhǎng)先增加后減少，當(dāng)培養(yǎng)基為MS＋BA 0.3mg/L＋NAA 0 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)和芽長(zhǎng)達(dá)到最大，說(shuō)明添加適量的BA，有助于芽的增殖和生長(zhǎng)。因此，白花樹的最佳增殖培養(yǎng)基為MS＋BA 0.3mg/L，不添加NAA。

2.3 生根培養(yǎng)

IBA處理對(duì)生根誘導(dǎo)的影響見表 3。對(duì)白花樹的生根誘導(dǎo)是木本植物試管快繁成功的關(guān)鍵。本試驗(yàn)采取兩階段、兩不同濃度發(fā)根誘導(dǎo)白花樹試管苗生根，6周后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果表明，當(dāng)IBA為100 mg/L處理時(shí)，生根率隨IBA處理時(shí)間加長(zhǎng)，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，處理3 d時(shí)，生根率最高，達(dá)到60%，平均根長(zhǎng)達(dá)到5.8 cm，根初為乳白色，后為黃綠色，根系發(fā)達(dá)；當(dāng)IBA為300 mg/L處理時(shí)，只有處理3 d的有發(fā)根，其余都沒有發(fā)根，愈傷組織偏多，且褐化程度大。因此，IBA濃度太高，處理的天數(shù)太長(zhǎng)，都不利于白花樹根的分化。

3 結(jié)論與討論

白花樹是優(yōu)良的油用、材用、藥用和觀賞樹種，具有很大的開發(fā)前景，目前有關(guān)其種子繁殖技術(shù)的報(bào)道也較多；本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究其組織培養(yǎng)的技術(shù)，豐富了白花樹的繁殖方法，為其以后的快速繁殖，良種選育和縮短育種周期提供了技術(shù)指導(dǎo)。

木本植物的組培快繁技術(shù)較難，目前能通過(guò)組培快繁的樹木種類只占很少的一部分，安息香科中只有秤錘樹（Sinojackia xylocarpa）有過(guò)組培的報(bào)道[15]。木本植物組培外植體的選用十分重要，本實(shí)驗(yàn)選用胚作為外植體，接種于MS培養(yǎng)基中。在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)比接種切除胚乳和不切除胚乳的胚，結(jié)果顯示，切除胚乳的，不僅可以減少污染率，而且7 d后就可以長(zhǎng)出子葉，含胚乳的卻要21 d，明顯縮短了胚的萌發(fā)時(shí)間。說(shuō)明胚外層的胚乳延緩了胚的生長(zhǎng)，而且在接種時(shí)增加了污染的概率，應(yīng)將胚乳切除。

木本植物組織培養(yǎng)中外植體的增殖不僅與植物生長(zhǎng)激素的種類由關(guān)，而且還與它的組合及濃度有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)研究了BA與NAA不同濃度組合對(duì)芽增殖的影響。外植體隨著BA濃度的增加，增殖系數(shù)和芽長(zhǎng)先增加后減少，隨著NAA濃度的增加，呈遞減趨勢(shì)。說(shuō)明NAA的添加不利于芽的增殖，而一定濃度的BA，可促進(jìn)芽的分化和增殖，并且在MS＋BA 0.3 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)和芽長(zhǎng)都達(dá)到最大。

生長(zhǎng)素對(duì)組培外植體不定根的誘導(dǎo)有顯著的作用。比較不同的生長(zhǎng)素作用效果差異發(fā)現(xiàn)，IBA促進(jìn)生根的效果較好[16]。但在生根預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用培養(yǎng)基 1/2MS＋I(xiàn)BA（0、1、3、10 mg/L）處理，植株不生根，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。采用兩階段誘導(dǎo)生根法，可以得到一定的緩解，用IBA處理不同天數(shù)，然后轉(zhuǎn)入 1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。生根誘導(dǎo)過(guò)程中，第1階段的時(shí)間控制十分關(guān)鍵，時(shí)間過(guò)短不能起到刺激生根的作用，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則植物愈傷組織增多，且容易褐化和枯梢；IBA濃度的控制也很重要，濃度過(guò)高則不利于植株的生根。IBA處理3 d，且濃度為100 mg/L，最適合白花樹的生根，6周后，平均根長(zhǎng)達(dá)5.8 cm，根系發(fā)達(dá)，但生根率只有60%。因此，對(duì)白花樹生根培養(yǎng)的篩選還有待進(jìn)一步研究。

[1] 中國(guó)樹木志編委會(huì). 中國(guó)樹木志·第二卷[M]. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1994.

[2] 柳新紅，雷祖培，陳征海，等. 浙江安息香屬一新記錄種：越南安息香[J]. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，29（2）：319－320.

[3] 吳克選,曾志光,周小平，等. 東京野茉莉野外調(diào)查報(bào)告[J]. 江西林業(yè)科技，2002（2）：25－27.

[4] 李因剛，周小平，柳新紅，等. 白花樹人工林生長(zhǎng)與優(yōu)樹選擇的初步研究[J]. 浙江林業(yè)科技，2010，30（3）：24-28.

[5] 胡文杰，司志國(guó)，曹裕松，等. 東京野茉莉油制備生物柴油的工藝條件研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（2）：380－382.

[6] 彭重華，張程，巫濤，等. 湖南安息香科種質(zhì)資源及其在園林中的應(yīng)用前景[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（7）：76－79.

[7] 范蘭禮. 東京野茉莉育苗和造林試驗(yàn)[J]. 江西林業(yè)科技，2001（4）：3－4.

[8] 孟中貴，周正. 安息香的引種栽培技術(shù)[J]. 中藥材，1992，15（4）：7－9.

[9] 戴曉龍. 東京野茉莉及繁育技術(shù)[J]. 特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2002（6）：21.

[10] 謝建秋，柳新紅，王軍峰，等. 東京野茉莉引種試驗(yàn)初報(bào)[J]. 浙江林業(yè)科技，2006，26（4）：33－35.

[11] 劉志強(qiáng)，肖水清，鄒元熹，等. 3種闊葉樹育苗技術(shù)及苗木生長(zhǎng)規(guī)律研究初報(bào)[J]. 江西林業(yè)科技，2010，（3）：14－15.

[12] Murshige T, Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures[J]. Physiol Plant, 1962，15（3）：473－497.

[13] 陳懿涵，桂仁意，林新春，等. 花稈綠竹試管快速繁殖[J]. 浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，25（3）：397－400.

[14] 曾余力，王旭峰，林新春，等. 白紋陰陽(yáng)竹試管快繁技術(shù)研究[J]. 西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，30（3）：38－41.

[15] 蔣澤平，梁珍海，吳綱，等. 秤錘樹的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 植物生理通訊，2005（4）：197.

[16] 李青林，皺永田，劉廣林，等. 木本光賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010 14（6）：38－41.

Experiment on Tissue Culture of Styrax tonkinensis

ZHANG Liang-liang1,2，LIU Xin-hong2，LIN Xin-chun1，LI Yin-gang2，SHI Cong-guang2，LIU Yi-li3，HE Yun-he1*
（1. Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 3. Qingtian Forestry Bureau of Zhejiang, Qingtian 323900, China）

Experiments on tissue culture of Styrax tonkinensis was conducted by taking the seeds as explants. The results showed that embryo without endosperm inoculated into medium could produce cotyledons earlier than that with endosperm, as well as reduce the contamination incidence and increase the survival rate. The best medium for propagation was MS medium + 0.3 mg/L of BA, the propagation coefficient reached 5.7, and the average bud length of 4.46 cm. Treatments with 100 mg/L IBA for 3 days had the best root induction effect, topped to 60 % of rooting rate.

Styrax tonkinensis; tissue culture; rapid propagation

S723.1＋32.6

B

1001-3776（2013）03-0016-04

2013-01-16；

2013-04-20

浙江省重大科技專項(xiàng)（優(yōu)先主題）農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2008C12019）；浙江省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2010F20014）；浙江省省院合作林業(yè)科技項(xiàng)目（2010SY05）；浙江省科技廳公益類項(xiàng)目（2012C22097）

張亮亮（1984－），男，浙江衢州人，碩士生，從事野生植物的開發(fā)與應(yīng)用研究；*通訊作者。