楨楠種子萌發(fā)過(guò)程中丙二醛和氧自由基的變化

孫雁霞，羅建勛，龍漢利，辜云杰，鄔曉勇*

（1. 成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都 610106；2. 四川省林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，四川 成都 610081）

楨楠種子萌發(fā)過(guò)程中丙二醛和氧自由基的變化

孫雁霞1，羅建勛2，龍漢利2，辜云杰2，鄔曉勇1*

（1. 成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都 610106；2. 四川省林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，四川 成都 610081）

對(duì)楨楠（Phoebe zhennan）種子在萌發(fā)過(guò)程中丙二醛（MDA）和氧自由基（ROS）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活性進(jìn)行了測(cè)定，以了解這些生理指標(biāo)在種子萌發(fā)過(guò)程中的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明：SOD活性在種子發(fā)芽過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)芽完全后出現(xiàn)下降，之后趨于平緩；MDA和ROS的含量變化則相反，從種子吸脹開(kāi)始到開(kāi)始發(fā)芽，一直處于下降趨勢(shì)，而在后期有上升趨勢(shì)，并趨于平緩，這說(shuō)明在楨楠種子萌發(fā)過(guò)程中SOD發(fā)揮了重要的作用，降低膜脂氧化程度，促進(jìn)種子發(fā)芽。

楨楠；種子萌發(fā)；丙二醛；氧自由基；超氧化物歧化酶

楨楠（Phoebe zhennan）為樟科常綠大喬木，我國(guó)三級(jí)保護(hù)漸危種，目前主要分布于四川、貴州、湖北、湖南及浙江等省。四川有天然的楨楠分布，是組成常綠闊葉林的主要樹(shù)種[1]。楨楠為中性偏陰的深根性樹(shù)種，生長(zhǎng)速度中等，木材材質(zhì)優(yōu)良，堅(jiān)硬耐腐，木材用途廣泛，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的名貴優(yōu)良用材樹(shù)種。同時(shí)因其樹(shù)形挺拔、枝葉繁茂、四季常青，也是很好的庭園觀賞和城市綠化樹(shù)種。

一般認(rèn)為種子在成熟和劣變過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化是其重要原因之一，體內(nèi)一些有害物質(zhì)的積累如氧自由基等對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜有極大的破壞作用[2]。丙二醛（MDA）是膜質(zhì)過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物，它的積累可能對(duì)膜和細(xì)胞造成一定的傷害。MDA的存在會(huì)毒害細(xì)胞膜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)和DNA，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜的降解和細(xì)胞功能的喪失[3]。MDA的含量低，膜受損程度越小，相反，則膜受損程度越大[4]。目前，對(duì)楨楠的研究主要集中在種子表型多樣性等方面的研究[1,5]，而對(duì)于其種子萌發(fā)過(guò)程中丙二醛和氧自由基的變化則未見(jiàn)報(bào)道，因此本試驗(yàn)以楨楠種子為材料，研究了在其萌發(fā)過(guò)程中丙二醛和氧自由基的含量變化，為楨楠種子的育種和林業(yè)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對(duì)象為楨楠種子，于2011年秋冬季種子成熟后地面拾集自然脫落的種子，根據(jù)采收地點(diǎn)不同，分別將種子編號(hào)為：楨楠76、楨楠36、楨楠81、楨楠34。種子經(jīng)沙藏層積處理后，于冰箱內(nèi)（4±1）℃貯藏后進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)芽試驗(yàn) 4種楨楠種子每種分3組，每組50粒，經(jīng)蒸餾水浸泡24 h后，置于雙層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，保持飽和含水量，在（25±1）℃的溫箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，光照條件為12 h光暗交替。發(fā)芽過(guò)程中如遇種子感染發(fā)霉，可用流水輕輕沖洗種子后放回發(fā)芽，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束[6]。指標(biāo)測(cè)定隔日進(jìn)行，三次重復(fù)（下同）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)器材 三氯乙酸、硫代巴比脫酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、石英砂、亞硝酸鈉，對(duì)氨基苯磺酸，a-萘胺，鹽酸羥胺等（各種藥品均為分析純）。

CT15RT型高速冷凍離心機(jī)、7 200型可見(jiàn)光分光光度儀、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、FA2004B型電子天平、DB-210SCB型電熱鼓風(fēng)干燥箱、冰箱、研缽、5 mL刻度離心管；刻度試管（10 mL）；鑷子；移液管（5、2、1 mL）等。

1.2.3 丙二醛的含量測(cè)定[7]隨機(jī)取培養(yǎng)皿中的種子，剝皮，洗凈擦干，放入到預(yù)冷的研缽中，加入一定體積預(yù)冷的0.05 mol/L、pH7.8的磷酸緩沖液，在冰浴下研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)移到刻度離心試管中，將研缽用緩沖液分3次洗凈，將清洗液合并入離心管中，于8 000 r/min、4℃下離心15 min，上清液即為丙二醛提取液。

將上述離心后所得的上清液用磷酸緩沖液定容到刻度試管，吸取一定提取液，加入0.5%硫代巴比妥酸溶液，搖勻。將試管放入沸水浴中煮沸10 min后，立即放入冷水浴中冷卻后，在8 000 r/min、4℃下離心15 min。離心后，以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白測(cè)532 nm、600 nm和450 nm處的消光值。

1.2.4 氧自由基的含量測(cè)定[7]制定亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線：配置系列濃度的NaNO2，然后取1 mL NaNO2，分別加入H2O 1 mL、17 mmol/L的對(duì)氨基苯磺酸1 mL和7 mmol/L的a-萘胺1 mL，于25℃中保溫20 min，然后測(cè)定OD530，以[NO2-]和測(cè)得的OD530值互為函數(shù)作圖，制得亞硝酸根回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

氧自由基提取液的制備：取種子，剝皮，洗凈擦干，然后放入研缽中，加入50 mmol/L pH7.8磷酸緩沖液進(jìn)行研磨，之后沖液洗研缽2次，最后以10 500 r/min離心20 min，得上清液并用緩沖液定容，此溶液為氧自由基提取液。

取樣品0.5 mL，加入50 mmol/L的磷酸緩沖液（pH7.8）0.5 mL、1 mmol/L的鹽酸羥胺1 mL搖勻，于25℃中保溫1 h，然后再加入17 mmol/L的對(duì)氨基苯磺酸1 mL和7 mmol/L的a-萘胺1 mL，混合，于25℃中保存20 min，取出以分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)在530 nm處的OD值。根據(jù)測(cè)得的OD530值，查亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，將OD530換成亞硝酸根，然后依照羥胺與O－.（超氧自由基）的反應(yīng)式：NHOH＋2O-.＋H＋→NO-＋HO＋HO從 [NO－

22222222] 對(duì) [O－2.] 進(jìn)行化學(xué)計(jì)量，即將 [NO2－] 乘以2，得到 [O－2.] 含量。

1.2.5 超氧化物歧化酶活性測(cè)定 SOD酶的提取方法參照參考文獻(xiàn)[8]?；钚詼y(cè)定采用鄰本三酚自氧化法。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)過(guò)程中MDA含量的變化

MDA的含量是反應(yīng)質(zhì)膜穩(wěn)定性的主要指標(biāo)[4]。細(xì)胞膜的破壞是由細(xì)胞中產(chǎn)生的超氧物自由基（ROS）誘導(dǎo)膜質(zhì)中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用造成的。脂質(zhì)過(guò)氧化作用會(huì)產(chǎn)生MDA，MDA的含量可代表膜損傷程度的大小。MDA的含量越高，植物細(xì)胞膜遭受的透性傷害越大。由圖 1可知，隨著種子遇水吸脹，代謝產(chǎn)物MDA的含量在萌發(fā)初期較高，但隨著時(shí)間的推移，可溶性蛋白增加，保護(hù)酶系統(tǒng)防御系統(tǒng)啟動(dòng)，MDA的含量隨之減少。從種子吸脹開(kāi)始到開(kāi)始發(fā)芽，MDA一直處于下降趨勢(shì)，說(shuō)明種子吸脹初期細(xì)胞膜有一個(gè)修復(fù)的過(guò)程，而在后期有上升趨勢(shì)，這可能與可溶性蛋白的大量消耗有關(guān)[9]。由圖可知，楨楠76的丙二醛含量在整個(gè)發(fā)芽過(guò)程中均比其余3種種子的含量低，丙二醛含量大小順序?yàn)椋簶E楠34 ＞ 楨楠81 ＞ 楨楠36 ＞ 楨楠76。這也與4種種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的規(guī)律一致。

2.2 種子萌發(fā)過(guò)程中ROS含量的變化

按照1.2.4的方法制定亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 6，線性關(guān)系良好。

在種子萌發(fā)過(guò)程中，氧自由基的含量隨著種子吸水到種子開(kāi)始發(fā)芽，均表現(xiàn)為降低的趨勢(shì)，如圖3。

植物細(xì)胞代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS），在正常生長(zhǎng)和代謝情況下，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡。細(xì)胞內(nèi)有清除ROS的非酶系統(tǒng)和酶系統(tǒng)，其中超氧化物歧化酶（SOD）第一個(gè)參與ROS的清除反應(yīng)，在抗氧化酶類中處于重要地位[10]。ROS含量的大小與丙二醛的含量變化一致。

2.3 種子萌發(fā)過(guò)程中SOD活性的變化

從圖4看出，楨楠種子在萌發(fā)過(guò)程中，SOD活性在種子發(fā)芽過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)芽完全后出現(xiàn)下降，之后趨于平緩。種子在萌發(fā)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一系列活性氧簇，而SOD不斷增加的活性可以把細(xì)胞中活性氧簇清除[11]，維持細(xì)胞正常的代謝活動(dòng)，而在后期活性的降低則可能是活性氧的含量有大幅度的下降。從圖中可以看出，SOD的活力表現(xiàn)為楨楠81最大，而楨楠34最小。

從以上3個(gè)指標(biāo)可以看出，楨楠種子在萌發(fā)過(guò)程中，確實(shí)有抗氧化酶活性的升高以及一些活性氧和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物含量的降低。

種子發(fā)芽過(guò)程是一個(gè)系統(tǒng)工程，離不開(kāi)蛋白質(zhì)和各種酶的參與。楨楠種子萌發(fā)過(guò)程中抗氧化保護(hù)酶、MDA以及ROS含量的變化，進(jìn)一步證明了種子萌發(fā)的系統(tǒng)性，種子萌發(fā)過(guò)程中，保護(hù)酶之間相互協(xié)同，使氧自由基的產(chǎn)生和清除達(dá)到平衡，同時(shí)降低了MDA含量，使植物細(xì)胞免受氧自由基的傷害，保證了種子的正常萌發(fā)。

3 討論與結(jié)論

種子在萌發(fā)期，種子中除成熟后積累的有害物質(zhì)代謝會(huì)產(chǎn)生活性氧外，呼吸等正常代謝、種子吸脹過(guò)快、環(huán)境脅迫等都會(huì)導(dǎo)致大量的活性氧產(chǎn)生，生成更多的自由基等有害物質(zhì)。在楨楠種子萌發(fā)過(guò)程中，SOD表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)，說(shuō)明在種子發(fā)芽過(guò)程中SOD有清除活性氧和阻止活性氧形成，保證種子的正常萌發(fā)的作用。

實(shí)驗(yàn)表明，種子在萌發(fā)過(guò)程中，ROS含量隨著種子吸水膨脹到發(fā)芽開(kāi)始，呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；SOD的活性也是隨著種子開(kāi)始發(fā)芽呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

植物器官衰老時(shí)，往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，MDA是其產(chǎn)物之一，它的存在會(huì)毒害細(xì)胞膜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)和DNA，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜的降解和細(xì)胞功能的喪失。MDA含量的高低在一定程度上可指示種子脂質(zhì)過(guò)氧化程度的高低[12～13]。由以上結(jié)果可知，在楨楠種子萌發(fā)過(guò)程中，由于抗氧化酶系統(tǒng)的活化，SOD清除ROS的能力增強(qiáng)，因此ROS作用于細(xì)胞質(zhì)膜的能力也減弱，故而其產(chǎn)物MDA的含量也降低。種子在未遇水吸脹萌發(fā)之前，處于自然老化過(guò)程，所以代謝產(chǎn)物MDA的含量在萌發(fā)初期較高，但隨著吸脹開(kāi)始，可溶性蛋白增加，保護(hù)酶系統(tǒng)防御系統(tǒng)啟動(dòng)，ROS產(chǎn)生速度變慢，MDA的含量隨之減少。

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Changes of Contents of MDA, ROS and SOD during Seed Germination of Phoebe zhennan

SUN Yan-xia1，LUO Jian-xun2，LONG Han-li2，GU Yun-jie2，WU Xiao-yong2
（1. Faculty of Biotechnology Industry, Chengdu University, Chengdu 610106, China; 2. Research Institute of Forestry, Sichuan Academy of Forestry, Chengdu 610081, China）

Determinations were conducted on content of malonicaldehyde(MDA), oxygen free radicals(ROS) and superoxide dismutase(SOD) activity during the process of germination of Phoebe zhennan seeds. Results showed that the activity of SOD increased with germination, and stabled after germination, while the content of MDA and ROS decreased first and increased later. The determinations concluded that SOD played an important role in reducing the degree of membrane lipid oxidation and promoted seed germination.

Phoebe zhennan; seed germination; MDA; ROS; SOD

S722.1

A

1001-3776（2013）03-0001-04

2012-11-20；

2013-01-11

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“四川地震災(zāi)區(qū)災(zāi)后植被恢復(fù)及可持續(xù)發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（201104109）

孫雁霞（1976－），女，山西大同人，博士，副教授，從事植物生理與生物技術(shù)研究；*通訊作者。