間充質(zhì)干細(xì)胞的特性及臨床應(yīng)用前景

張 平 張本恕(河北大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 保定 07000)

2007年英國科學(xué)家 Chamberlain等〔1〕在Stem Cell雜志上撰文指出:成體干細(xì)胞對人體自我修復(fù)和組織再生至關(guān)重要，成體干細(xì)胞的減少是人體衰老的主要原因。這一發(fā)現(xiàn)對于人類理解衰老過程以及干細(xì)胞移植具有重要的意義，這也是近年干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)研究蓬勃發(fā)展的原因。目前，科學(xué)家致力于發(fā)現(xiàn)和制造一種無倫理學(xué)限制、無免疫排斥、對供受者無損害、取材方便、純度高而又保持生物特性的干細(xì)胞，以滿足基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的需要。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是成體干細(xì)胞家族的重要成員，最近醫(yī)學(xué)領(lǐng)域乃至整個生命科學(xué)領(lǐng)域的研究重點和前沿。

1 MSCs概述

MSCs源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，屬于非終末分化細(xì)胞，它既有間質(zhì)細(xì)胞，又有內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞的特征。1976年Friedenstein和他的同事〔2〕證實了骨髓MSCs的存在，起初認(rèn)為此種細(xì)胞僅存在于骨髓，然而近幾年發(fā)現(xiàn)，MSCs還可來源于其他組織〔3～6〕，如脂肪組織、胎兒組織、羊水、骨膜。研究證實人體各個器官和組織都存在 MSCs〔7，8〕，并且從不同的動物貓、狗、狒狒、豬均可獲得。MSCs的數(shù)量隨著年齡增長〔9〕和身體虛弱〔10〕下降，新生兒的 MSCs的量最多，然后到80歲時大約下降50%〔9〕。

臨床上獲得MSCs的方法最通常是從骨髓中分離，常用的骨髓MSCs分離與培養(yǎng)方法有貼壁培養(yǎng)篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀或免疫磁珠分選法。貼壁篩選法是根據(jù)干細(xì)胞貼壁特性，定期換液除去不貼壁細(xì)胞，如造血系細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，達(dá)到分離純化干細(xì)胞的目的，此方法操作簡單，對細(xì)胞損傷小。密度梯度離心法是根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分比重的不同，提取單核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。雖然密度梯度離心法理論上可以在原代獲得較純化的細(xì)胞，但MSCs公認(rèn)的密度尚未明確，離心過程中不可避免地造成細(xì)胞損失，且離心后仍需用貼壁法進(jìn)一步純化，其優(yōu)勢并不明顯。近年人們又根據(jù)骨髓MSCs表達(dá)的某些細(xì)胞表面抗原進(jìn)行收集〔11，12〕，或根據(jù)其表面不表達(dá)的抗原進(jìn)行負(fù)選〔13～15〕，采用流式細(xì)胞篩選法和免疫磁珠法來分選細(xì)胞。這兩種方法因骨髓MSCs缺乏特異性的表面標(biāo)志，成本高、技術(shù)難度大，所需骨髓量大，并且對細(xì)胞的活性影響較大而未廣泛應(yīng)用。因此目前常用方法仍為貼壁法和密度梯度離心法。

2 MSCs的生物學(xué)特性

2.1 MSCs的形狀和超微結(jié)構(gòu) 原代培養(yǎng)的骨髓MSCs形態(tài)多樣，主要可分為三種形態(tài):①細(xì)胞呈紡錘形或梭形，數(shù)量較少;②細(xì)胞呈扁平狀，多角形，立體感不強(qiáng)，數(shù)量比較多;③細(xì)胞呈輕度的立方形，數(shù)量少，此類細(xì)胞增殖速度快，多向分化能力強(qiáng)〔16〕。傳代后的骨髓 MSCs形態(tài)不同實驗室報道有所不同〔17，18〕。人骨髓MSCs在透射電鏡下表現(xiàn)為兩種不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)類型:①相對靜息期的細(xì)胞:核較大，橢圓形，僅含1個核仁，核質(zhì)比較大，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器少;②處于相對活躍期的細(xì)胞:細(xì)胞體積大于前者，核呈不規(guī)則形，有核袋及核突，含2～3個核仁，核質(zhì)比較小，胞質(zhì)中有豐富的細(xì)胞器，如核糖體、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等，提示該細(xì)胞具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)合成能力，是其能夠分泌許多生長因子維持自身生長分化、支持造血干細(xì)胞造血的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在相鄰細(xì)胞間可見到一些細(xì)胞膜局部電子密度增高、細(xì)胞膜內(nèi)顆粒相互融合的縫隙連接，縫隙連接可加強(qiáng)相鄰細(xì)胞的連接，且是細(xì)胞的一種通訊結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞間信息傳遞，與細(xì)胞分泌、增殖、分化相關(guān)。骨髓MSCs間縫隙連接揭示骨髓MSCs有分泌生長調(diào)節(jié)因子的能力，增殖能力強(qiáng)，分化程度低。掃描電鏡下MSCs呈長梭形、魚群狀排列，表面有許多微絨毛〔19〕，說明細(xì)胞功能活躍，分泌能力強(qiáng)，可攝取大量營養(yǎng)物質(zhì)以供較強(qiáng)生長增殖所需。

2.2 MSCs具有多向分化特性 近年來發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞在特定條件下可分化為多種組織譜系的細(xì)胞，包括脂肪細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。目前相當(dāng)多的實驗已證實，在適當(dāng)?shù)臈l件下，MSCs可以分化為脂肪、成骨、軟骨、骨骼肌、心肌、肌腱等中胚層來源的細(xì)胞，而且還可以橫向分化〔20〕為外胚層，如神經(jīng)細(xì)胞〔21〕及內(nèi)胚層細(xì)胞，如肝細(xì)胞和胰島細(xì)胞〔22，23〕。另外MSCs的多向分化潛能具有高度的進(jìn)化保守性，人、狒狒、犬、兔、大鼠和小鼠，甚至禽類的骨髓MSCs均有相似的特點〔24〕。

2.3 MSCs具有“歸巢” MSCs有歸巢現(xiàn)象，尤其組織有損傷或在病理條件下。在體內(nèi)，植入的MSCs可以在體內(nèi)損傷組織微環(huán)境的作用下，遷移定位并分化為相應(yīng)的組織細(xì)胞。Jiang等〔24〕將預(yù)先標(biāo)記的骨髓MSCs經(jīng)靜脈植入急性心肌缺血模型的大鼠體內(nèi)，術(shù)后在心肌缺血組織中發(fā)現(xiàn)了骨髓MSCs分化的心肌細(xì)胞，說明植入的骨髓MSCs歸巢(homing)至受損部位并分化為心肌細(xì)胞。類似的結(jié)果還可以在肌肉損傷〔25〕、腦損傷等很多模型中見到。體內(nèi)外實驗均證實MSCs具有從血中穿過上皮細(xì)胞，到達(dá)組織中〔26～29〕的能力，體外實驗〔30〕內(nèi)皮細(xì)胞和MSCs在共培養(yǎng)時，MSCs與內(nèi)皮細(xì)胞組織接觸30 min后形態(tài)即發(fā)生變化，2 h后變扁與內(nèi)皮細(xì)胞層整合在一起，這些結(jié)果表明，縱然在體外MSCs也可以有效的細(xì)胞和細(xì)胞接觸，且開始遷徙穿過內(nèi)皮細(xì)胞;體內(nèi)試驗〔30〕，MSCs通過主動脈套管注入大鼠，2 h后發(fā)現(xiàn)心臟血管的內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接小時，MSCs可以和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，30 min后在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)大約30%的細(xì)胞穿過內(nèi)皮細(xì)胞，60 min后大約50%細(xì)胞穿過，此后隨著時間的延長穿過的細(xì)胞數(shù)逐漸增多。

MSCs自血中穿過上皮細(xì)胞，到達(dá)受損的組織，具體機(jī)制尚不清楚，但是有可能是受損的組織表達(dá)特定的受體或配體促進(jìn)MSCs的遷徙、黏附和侵潤到損傷的組織，就如同白細(xì)胞向炎性組織遷移。趨化因子受體和趨化因子配體是白細(xì)胞遷徙的必要物質(zhì)，最近在MSCs表面也發(fā)現(xiàn)了這些分子。趨化細(xì)胞因子是一個小分子糖蛋白超家族成員，和很多生物過程有關(guān)系，包括白細(xì)胞運(yùn)輸、血細(xì)胞生成、血管發(fā)生和器官形成。研究認(rèn)為43%-70% 的人骨髓MSCs表面表達(dá)功能性趨化因子CCR1，CCR7，CCR9，CXCR4，CXCR5 和 CXCR6〔31〕。而另一組通過反轉(zhuǎn)錄PCR和免疫組化的實驗認(rèn)為表達(dá)的是 CCR2，CCR8，CXCR1，CXCR2，and CXCR3〔32〕。Ponte 和他的同事〔33〕研究證實hMSCs表達(dá) CCR2，CCR3，CCR4，and CXCR4，而且 TNF-α 可以增加CCR2，CCR3，and CCR4表達(dá)而不是CXCR4。因此，MSCs表達(dá)多種趨化因子受體，盡管報道不一樣，但正好反映了MSCs的多樣性，這也是MSCs的一個特點。事實上，正因為MSCs表面表達(dá)多種趨化因子受體，MSCs才可以向不同組織遷徙，起到修復(fù)受損組織或緩解炎癥反應(yīng)的作用。如表達(dá)CCR9的MSCs可以遷徙到小腸，或表達(dá)CCR1的MSCs可以遷徙到有炎癥的關(guān)節(jié)或有病變的腦組織。

研究證實MSCs表面表達(dá)整合素，選擇素，趨化因子受體促使MSCs自血液中滾動、黏附、移行穿過血管壁到達(dá)組織而發(fā)揮生物學(xué)作用，與白細(xì)胞穿過血管壁的過程相似，但是二者也有區(qū)別點。如多項試驗證實〔34～38〕，MSCs細(xì)胞表面有 P-選擇素表達(dá)，而L-選擇素和E-選擇素表達(dá)水平低或是不表達(dá)，故認(rèn)為在最初MSCs在血管壁滾動階段P-選擇素起重要作用。研究MSCs表面趨化因子受體和黏附分子的作用，以更好實現(xiàn)體外培養(yǎng)MSCs向損傷組織移行，這將使MSCs支持組織再生，修正遺傳缺陷，減緩慢性炎癥反應(yīng)，以及用這些細(xì)胞作為生物制劑或基因良好載體成為可能。

2.4 MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用 MSCs屬于未成熟的成體干細(xì)胞，自身免疫原性低，同種異體移植后無排斥反應(yīng)或反應(yīng)較弱〔39〕，在外周耐受，移植耐受，自身免疫，腫瘤逃逸以及母-胎兒耐受過程中是重要的免疫調(diào)節(jié)劑〔40，41〕。具體的機(jī)制可能與母體能夠耐受類似胎兒的異體移植物的機(jī)制相似，MSCs不表達(dá)與人類白細(xì)胞抗原(HLA)識別相關(guān)的協(xié)同刺激分子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)以及主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類分子的HLA-DR產(chǎn)物等。MSCs能夠抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞行使功能，當(dāng)MSCs與應(yīng)答T細(xì)胞共同培養(yǎng)時非但不會引起T細(xì)胞聚集，反而會抑制T細(xì)胞增殖，研究證實T淋巴細(xì)胞的增殖被阻止在G1階段，認(rèn)為是由于MSCs的干預(yù)使得細(xì)胞周期蛋白D下調(diào)所致〔42〕。而T細(xì)胞失去應(yīng)答并不是發(fā)生凋亡，是可逆的。如果撤除MSCs的干預(yù)，給予合適的刺激，T淋巴細(xì)胞可以重新增殖〔43〕;另外 Corcione等〔44〕的實驗證實 MSCs能顯著減少B淋巴細(xì)胞IgM、IgG、IgA的分泌;不僅是未分化的MSCs，已分化的MSCs也不會引起淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，如Le Blanc等〔45〕實驗證實未分化的人胎兒MSCs表達(dá)HLAⅠ類分子，不表達(dá)HLAⅡ類分子，在誘導(dǎo)MSCs分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞后，HLAⅠ類分子表達(dá)增加，但在細(xì)胞表面仍檢測不到Ⅱ類分子的表達(dá)。當(dāng)將誘導(dǎo)后的細(xì)胞作為刺激物，與異體的T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，仍未引起淋巴細(xì)胞的排斥反應(yīng)。研究表明:可溶性因子和細(xì)胞接觸介導(dǎo)的機(jī)制參與此過程，在使用一些起拮抗作用單克隆抗體阻斷轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)的實驗中表明這些因子起碼部分參與了MSCs免疫調(diào)節(jié)過程〔46〕。盡管MSCs免疫逃逸和免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制不完全清楚，但無疑使同種異體MSCs的移植應(yīng)用成為可能〔47〕。

最近有學(xué)者利用MSCs的免疫調(diào)節(jié)治療自身免疫性疾病的患者，收到很好的臨床效果〔48〕。另外我們注意到MSCs的免疫抑制作用在治療劇烈移植物抗宿主病(GVHD)時是非常重要的，但對于腫瘤的治療，由于移植的MSCs的免疫抑制作用可能會導(dǎo)致對腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)的下降，限制MSCs在腫瘤治療中的應(yīng)用。

3 MSCs在臨床應(yīng)用的現(xiàn)狀和前景

3.1 MSCs細(xì)胞治療 MSCs的可塑性和自我更新能力為臨床上組織再生治療提供了巨大的潛能。原因:①MSCs在一些特殊的組織可以替代特異性的干細(xì)胞，模擬正常細(xì)胞的生長并建立新的組織。②MSCs及其衍生細(xì)胞在特殊的微環(huán)境下分化成為特殊類型的細(xì)胞，這些分化后的細(xì)胞不僅僅是間充質(zhì)組織，還有可能是內(nèi)胚層和/或外胚層的組織。③MSCs在特殊時期特殊場所可以幫助組織再生，也就組織特異性的細(xì)胞與MSCs形成異核體;④移植的MSCs可以通過產(chǎn)生一些旁分泌因子如生長因子，細(xì)胞因子，趨化因子〔49〕來促進(jìn)組織特異性的細(xì)胞增殖，或者至少是阻止組織進(jìn)一步被破壞并幫助它修復(fù)。

MSCs在治療先天性骨形成不良和變性關(guān)節(jié)炎等方面有一定效果。骨形成不良是一種遺傳性疾病，主要原因是不能形成Ⅰ型膠原，導(dǎo)致骨礦減少，臨床表現(xiàn)為多發(fā)性骨折、嚴(yán)重的骨畸形和身材矮小。給3例患者移植異體MSCs 3個月后，可見1.5%～2.0%的供體細(xì)胞，骨礦含量增加，生長加速，骨折減少，提示 MSCs移植可以治療部分遺傳性疾病〔50〕。2009年Dharmasaroja指出〔51〕MSCs移植治療腦缺血動物模型，在體內(nèi)可以分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、誘發(fā)神經(jīng)再生和血管再生、激發(fā)內(nèi)源性神經(jīng)恢復(fù)過程，從而獲得滿意的實驗結(jié)果。

3.2 MSCs的基因治療 基因工程細(xì)胞:即在體外對供體細(xì)胞用基因重組技術(shù)導(dǎo)入或刪除某一或某些基因以改變細(xì)胞的表型(包括生長特性，對毒物的抵抗能力以及生產(chǎn)分泌某些治療性蛋白)等，即進(jìn)行遺傳修飾過的細(xì)胞。

近年來，利用基因工程細(xì)胞進(jìn)行替代治療和基因治療已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域乃至整個生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點和前沿課題，尋找合適的載體和供體細(xì)胞是基因治療中最為困難的技術(shù)。目前所用的大部分載體細(xì)胞都存在問題，如基因操作困難，所攜帶基因不能長期高效表達(dá)，移植排斥反應(yīng)難以避免等。因而限制了其在臨床中的應(yīng)用。為提高基因治療的效率，多年來人們不斷尋求理想的載體。現(xiàn)所用的有病毒載體及體細(xì)胞載體。用于轉(zhuǎn)基因的體細(xì)胞要求取材方便，含量豐富，容易培養(yǎng)，壽命較長。因此人們把目光投向了干細(xì)胞。干細(xì)胞有多種，最早研究的是造血干細(xì)胞，近年來，又有幾類干細(xì)胞加入這一行列，諸如胚胎干細(xì)胞(ESCs)，神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，MSCs等，各具特色。MSCs作為基因治療的載體細(xì)胞與其他組織干細(xì)胞相比具有許多優(yōu)勢:①來源充足，取材較易;②不象ESCs的來源受到倫理道德的制約;③MSCs的分離培養(yǎng)操作簡單，體外培養(yǎng)容易大量擴(kuò)增;④MSCs的移植排斥反應(yīng)弱。因此MSCs是很好的基因載體。

MSCs基因治療的研究在各個專業(yè)廣泛開展且已有用于臨床者。最先開始于骨科，Chamberlain等〔52〕則利用基因修飾MSCs來治療成骨不全，修飾后的MSCs比未經(jīng)修飾的對照組成骨質(zhì)量明顯提高。MSCs還可以在變性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)中形成新的關(guān)節(jié)面，從而加速關(guān)節(jié)的恢復(fù)〔53〕。在血液學(xué)方面，學(xué)者將凝血因子Ⅶ或Ⅸ通過腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓MSCs，從而達(dá)到治療血友病的目的〔54〕。因而基因工程MSCs或許是治療血友病或其他因循環(huán)中蛋白缺陷所致的基因病的有效載體。在腫瘤學(xué)方面，MSCs用作β-干擾素的載體導(dǎo)入體內(nèi)腫瘤組織可抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長〔55〕。在用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方面，對于神經(jīng)變性疾病的研究已較為肯定，Schwarz等人〔56〕則利用可以表達(dá)L-DOPA的基因工程MSCs為供體細(xì)胞移植治療帕金森病，在動物模型中取得了較明顯的效果。另外，MSCs在用于治療腦缺血及腦出血疾病動物模型方面的研究也在多方面展開，MSCs對動物模型腦損傷后功能的恢復(fù)非常顯著〔57，58〕。有學(xué)者〔59〕用腺病毒介導(dǎo)Bcl-2基因修飾MSCs，體外實驗證實Bcl-2基因表達(dá)并且可以降低MSCs死亡率32%，在低氧狀態(tài)下增加血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)量超過60%;通過心室內(nèi)注射Bcl-2基因修飾MSCs于左前降支結(jié)扎后的急性心肌梗死動物模型，梗死區(qū)的血管密度增加15%比單純移植空載體修飾MSCs的動物模型組，梗死面積減小17%，心臟功能明顯恢復(fù)，因此移植抗凋亡基因修飾MSCs是治療急性心肌梗死的一項積極有效的方法。腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的配體(stTRAIL)能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡凋亡而對正常組織和細(xì)胞無毒性，有研究〔60〕腺病毒介導(dǎo)腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的配體基因修飾臍帶血MSCs治療顱內(nèi)膠質(zhì)瘤，發(fā)現(xiàn)明顯抑制腫瘤的生長，延長帶瘤鼠的生存期，證明臍帶血MSCs可以作為有效的治療基因的載體來治療顱內(nèi)膠質(zhì)瘤。

4 展望

到目前為止，大量臨床結(jié)果證實體內(nèi)應(yīng)用MSCs是安全的、可行的，MSCs在再生醫(yī)學(xué)和基因治療方面具有巨大潛能，充分了解MSCs生物學(xué)特性為臨床各種疾病甚至一些目前不可治療的疾病提供新的更先進(jìn)的更有效的治療帶來了希望，展示美好的前景。

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