?；撬崧?lián)合血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑對(duì)大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用

馬曉薇 羅永艾 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400016)

急性肺損傷(ALI)是由多種病因引起的肺泡-毛細(xì)血管膜損傷，并伴有肺內(nèi)大量分流及嚴(yán)重低氧血癥的臨床綜合征〔1〕。目前研究認(rèn)為其死亡率高的原因與診斷較晚及缺乏新的治療方法有關(guān)。最新研究表明〔2〕，ALI是一種失控的炎癥反應(yīng)，以肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)及肺泡上皮廣泛損傷為病理特征，中性粒細(xì)胞(PMN)于肺內(nèi)大量羈留是導(dǎo)致上述損傷的關(guān)鍵，并且肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在ALI的早期及其發(fā)展變化中常伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞的廣泛激活〔3〕。已有研究顯示，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑〔4〕和?；撬帷?〕對(duì)ALI均有保護(hù)作用。本研究通過建立 ALI大鼠的動(dòng)物模型，觀察ALI大鼠內(nèi)皮活化和損傷的情況以及?；撬岷虯CEI干預(yù)后急性肺損傷大鼠內(nèi)皮細(xì)胞的變化情況，探討血管內(nèi)皮活化和損傷在ALI中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并觀察?；撬崧?lián)合ACEI可能的肺損傷保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康雄性清潔級(jí)SD成年大鼠130只(體重160±20)g(寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);脂多糖(L2880，Ecolia O55，B5)，購自 Sigma公司;卡托普利原料藥(常州制藥廠有限公司饋贈(zèng));牛磺酸原料藥:購自Sigma公司;可溶性細(xì)胞間黏附分子-1(sICAM-1)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、血管性血友病因子(vWF)試劑盒購自為民生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 130只大鼠，隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組(n=10)，脂多糖組，牛磺酸組，卡托普利組，?；撬岷涂ㄍ衅绽M，每組30只，分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)。脂多糖組:腹腔注射脂多糖0.5 mg/kg，預(yù)激12 h，腹腔注射氯胺酮75 mg/kg麻醉后，給予頸靜脈置管注射脂多糖5 mg/kg，建立ALI模型。正常對(duì)照給予等量生理鹽水。?；撬峤M:脂多糖預(yù)激后12 h后，同上法麻醉，腹腔注射牛磺酸50 mg/kg，頸內(nèi)靜脈置管注射脂多糖5 mg/kg，3、6、9、12、24 h 時(shí)間點(diǎn)采集標(biāo)本?？ㄍ衅绽M:脂多糖預(yù)激后12 h后，同上法麻醉，腹腔注射卡托普利1.25 mg/kg，頸內(nèi)靜脈置管注射脂多糖 5 mg/kg，3、6、9、12、24 h 時(shí)間點(diǎn)采集標(biāo)本;牛磺酸和卡托普利組:脂多糖預(yù)激后12 h后，同上法麻醉，腹腔注射?；撬?0 mg/kg和卡托普利1.25 mg/kg，頸內(nèi)靜脈置管注射脂多糖 5 mg/kg，3、6、9、12、24 h 時(shí)間點(diǎn)采集標(biāo)本。

1.2.2 標(biāo)本采集 心臟采血 2 ml，EDTAK2管抗凝，3 000 r/min離心，留取血漿，-80℃低溫冰箱保存待檢。同時(shí)放血處死動(dòng)物，暴露頸部，氣管切開置入插管，結(jié)扎右肺，右上肺葉10%中性緩沖甲醛液組織固定后石蠟包埋，切片，HE染色。左肺經(jīng)氣管插管，4℃冰鹽水1.5 ml肺泡灌洗，反復(fù)回抽3次，留取肺泡灌洗液，3 000 r/min，20 min離心，取上清液，-80℃低溫冰箱保存待檢。

1.3 檢測指標(biāo) 右上肺葉10%中性緩沖甲醛溶液組織固定后石蠟包埋，切片，HE染色觀察肺組織。ELISA法分別檢測血漿及肺泡灌洗液中的可溶性細(xì)胞間黏附分子-1(sICAM-1)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、血管性血友病因子(vWF):按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)變化 光鏡下見正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔及支氣管腔未見炎癥細(xì)胞及滲出物。肺損傷組雙肺腫脹，體積增大，重量增加，色澤暗淡，肺表面多見散在出血點(diǎn)，部分肺表面可見片狀實(shí)變和梗死灶，支氣管及肺組織切面有白色或淡紅色泡沫狀液體溢出。光鏡下病變廣泛，主要表現(xiàn)為肺組織水腫，小血管周圍水腫套形成，管壁壞死及肺出血，灶性肺萎陷及肺氣腫，較多中性白細(xì)胞浸潤及部分單核細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞浸潤，偶見微血栓及肺透明膜形成，部分小支氣管腔見水腫液和白細(xì)胞，個(gè)別支氣管黏膜壞死和脫落，可見點(diǎn)、片狀出血，顯示炎癥和輕度肺水腫現(xiàn)象，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔變窄。?；撬峤M、卡托普利組和?；撬峒翱ㄍ衅绽M上述病理變化改善，尤其以?；撬峒翱ㄍ衅绽M上述病理變化改善明顯。見圖1～圖5。

圖1 正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)(HE，×200)

圖2 肺損傷組肺組織病理學(xué)變化(HE，×200)

2.2 各組血漿、肺灌注液中sICAM-1水平 血漿中sICAM-1在肺損傷組中所有時(shí)間點(diǎn)均較正常值升高，尤以3，6，9，12 h點(diǎn)明顯(P＜0.01)。其余各治療組均較肺損傷組下降，但仍較正常值略高(P＜0.05)。肺泡灌洗液中sICAM-1在肺損傷組較正常對(duì)照組明顯升高，尤以3，6 h點(diǎn)明顯(P＜0.01)。?；撬峤M、卡托普利3，6 h組均較肺損傷組有所下降，并略高于正常對(duì)照組，在9、12、24 h點(diǎn)逐漸恢復(fù)正常。肺灌洗液中sICAM-1牛磺酸加卡托普利組較肺損傷組下降明顯(P＜0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠血漿肺灌洗液ET-1水平 血漿中ET-1肺損傷組在3，6，9，12 h時(shí)間點(diǎn)較正常對(duì)照組升高，而在24 h升高不明顯，各治療組較肺損傷組略有降低。肺泡灌洗液中ET-1肺損傷組較正常對(duì)照組有升高，各治療組在不同的時(shí)間點(diǎn)較損傷組下降，見表2。

2.4 各組大鼠血漿、肺灌洗液vWF水平 血漿中vWF肺損傷組各時(shí)間點(diǎn)均較正常對(duì)照組升高，各治療組在不同的時(shí)間點(diǎn)較肺損傷組降低(均P＜0.01)，但仍較正常對(duì)照組略高;肺泡灌洗液中肺損傷組各時(shí)間點(diǎn)均較正常對(duì)照組升高。各治療組在不同的時(shí)間點(diǎn)較損傷組下降，接近正常對(duì)照組。見表3。

表1 各組大鼠血及肺灌洗液中sICAM-1水平( s，ng/L)

表1 各組大鼠血及肺灌洗液中sICAM-1水平( s，ng/L)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.01，與肺損傷組比較:2)P＜0.05，下表同

2 50.09±1.42血漿 215.93±5.23 215.93±5.23 215.93±7.77 215.93±5.23 215.93±5.23肺損傷組 6 肺灌洗液 81.28±18.171) 72.41±5.471) 63.79±6.3011) 67.82±1.901) 65.54±6.241)血漿 351.36±87.161) 335.97±87.161) 293.24±6.251) 281.3±17.491) 404.83±57.371)?；撬峤M 6 肺灌洗液 65.55±8.812) 44.43±1.412) 47.67±0.942) 54.73±5.122) 61.42±11.402)血漿 305.47±76.552) 255.54±21.452) 231.17±19.022) 263.26±43.062) 280.98±39.612)卡托普利組 6 肺灌洗液 52.26±2.162) 60.94±3.072) 59.94±9.092) 49.60±0.612) 48.23±3.302)血漿 267.33±67.192) 312.22±44.652) 274.89±35.282) 226.05±8.322) 299.38±90.292)牛磺酸+卡托普利組 6 肺灌洗液 65.47±0.792) 64.86±10.272) 58.51±6.042) 54.48±12.592) 51.35±2.892)血漿 287.28±88.432) 266.17±54.402) 213.04±33.882) 295.24±62.722) 281.00±43.632)3 h 6 h 9 h 12 h 24 h正常對(duì)照組 2 肺灌洗液 50.09±1.42 50.09±1.42 50.09±1.42 50.09±1.4組別 n

表2 各組大鼠血漿、肺灌洗液中ET-1水平(s，μg/L)

表2 各組大鼠血漿、肺灌洗液中ET-1水平(s，μg/L)

6 16.40±0.36血漿 80.18±1.04 80.18±1.04 80.18±1.04 80.18±1.04 80.18±1.04肺損傷組 6 肺灌洗液 18.05±0.831) 17.66±0.651) 17.03±1.651) 17.31±1.131) 17.16±0.26血漿 87.71±0.771) 86.26±0.541) 84.79±4.531) 88.64±1.501) 76.65±2.82?；撬峤M 6 肺灌洗液 18.22±0.632) 14.66±0.252) 15.62±0.522) 15.52±1.432) 15.77±0.232)血漿 75.00±0.54 80.93±5.24 80.89±2.01 75.42±3.41 67.06±18.38卡托普利組 6 肺灌洗液 17.38±0.272) 16.62±4.492) 16.56±1.072) 16.18±0.212) 15.75±1.252)血漿 77.80±1.08 85.25±2.75 80.19±5.79 78.54±1.96 72.99±3.03?；撬?卡托普利組 6 肺灌洗液 17.24±0.132) 16.42±0.182) 16.75±0.342) 16.04±0.972) 15.01±0.192)血漿 84.89±3.90 82.61±3.80 81.06±4.02 81.73±2.2 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h正常對(duì)照組 2 肺灌洗液 16.40±0.36 16.40±0.36 16.40±0.36 16.40±0.3組別 n 9 80.28±0.76

表3 各組大鼠血漿、肺灌洗液中vWF水平( s，ng/L)

表3 各組大鼠血漿、肺灌洗液中vWF水平( s，ng/L)

±1.82 443.73±1.82血漿 2 305.10±97.01 2 305.10±97.01 2 305.10±97.01 2 305.10±97.01 2 305.10±97.01 LPS組 6 肺灌洗液 765.60±1.541) 697.48±1.341) 687.04±1.8291) 651.48±3.981) 586.29±3.7221)血漿 4 584.40±200.101) 4 950.10±2.941) 4 731.60±3.721) 4 110.10±2.801) 3 511.10±100.521)?；撬峤M 6 肺灌洗液 553.64±125.982) 569.24±38.932) 582.66±34.732) 607.57±63.442) 557.77±20.842)血漿 3 450.90±229.072)3 493.90±151.872)2 924.60±222.882)3 269.80±221.822)2 926.00±387.862)卡托普利組 6 肺灌洗液 705.00±1.652) 623.03±63.792) 642.95±71.942) 576.46±84.022) 538.32±27.042)血漿 2 332.00±257.392)3 496.50±61.042)3 584.30±519.342)3 316.40±173.072)2 883.40±498.112)?；撬?卡托普利組 6 肺灌洗液 636.11±96.362) 592.01±12.772) 668.09±289.232) 628.10±72.482) 531.88±75.922)血漿 3 062.00±279.302)3 996.60±297.342)2 898.70±100.802)4 295.00±988.342)2 835.30±107.302)3 h 6 h 9 h 12 h 24 h正常對(duì)照組 2 肺灌洗液 443.70±1.82 443.73±1.82 443.73±1.82 443.73組別 n

圖3 ?；撬峤M肺組織病理學(xué)變化(HE，×200)

圖4 卡托普利組肺組織病理學(xué)變化(HE，×200)

圖5 ?；撬岷涂ㄍ衅绽M肺組織病理學(xué)變化(HE，×200)

3 討論

ALI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及環(huán)節(jié)多，受損的靶細(xì)胞多，雖然目前相應(yīng)治療手段已取得了一些進(jìn)展，但發(fā)病率和死亡率仍較高，病死率是30% ～40%〔6〕。炎癥反應(yīng)失控是其中的主要原因，而其導(dǎo)致的彌漫性肺泡損傷是疾病的主要病理特征。目前真正用于臨床治療的有效手段只有小潮氣量通氣，因而ALI的死亡率居高不下。血管內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋于血管內(nèi)側(cè)面的單層扁平上皮細(xì)胞，除對(duì)各種大分子物質(zhì)和血細(xì)胞成分進(jìn)入周圍組織起選擇性通透屏障作用外，還具有重要的內(nèi)分泌功能，在調(diào)節(jié)序貫舒縮狀態(tài)及通透性、對(duì)抗血小板聚集、維持血管壁完整方面均有重要的意義〔7〕。本研究顯示在ALI時(shí)，肺血管滲漏增加;其次，在ALI時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞活化的細(xì)胞因子即sICAM-1、ET-1和vWF在血漿及肺泡灌洗液中均升高，隨著不同的時(shí)間點(diǎn)而不同，在3、6、9 h這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)較為明顯，在12、24 h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)升高的值逐漸下降接近正常。因此，在ALI早期，存在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和損傷。如果針對(duì)這一環(huán)節(jié)進(jìn)行治療，將會(huì)對(duì)ALI具有保護(hù)作用。

?；撬嵬ㄟ^其抗氧化作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的流動(dòng)，阻止人內(nèi)皮細(xì)胞功能喪失和細(xì)胞死亡，同時(shí)還可通過降低白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用來阻止白介素-2誘導(dǎo)的肺組織損傷。此外，?；撬峥娠@著減輕ALI時(shí)PMN的聚集，其機(jī)制可能與?；撬嶙鳛榭寡趸瘎┮砸种芅F-κB的活化有關(guān)〔8〕。本研究?；撬峥赏ㄟ^減輕活化的中性粒細(xì)胞引起的內(nèi)皮損傷以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子流量來防止內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，增加中性粒細(xì)胞活力，在阻止進(jìn)一步的肺損傷中起到一定的治療作用〔9〕。文獻(xiàn)報(bào)道，?；撬嶂委熀罂梢詼p輕內(nèi)毒素引起的細(xì)胞形態(tài)和生化方面的改變，因此?；撬峋哂袃?nèi)在的抗炎和抗氧化作用，可以阻止ALI的進(jìn)一步惡化而起到治療作用〔4〕。而本實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了?；撬釋?duì)ALI有保護(hù)作用，可以降低內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和活化。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)長期應(yīng)用于高血壓的治療，在1996年被肯定對(duì)血管內(nèi)皮功能障礙具有改善作用〔10〕。本研究提示血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑對(duì)ALI時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞活化和損傷有保護(hù)作用，其可能的作用機(jī)制是通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞合成血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和ET-1的生成，增加緩激肽的濃度以及降低AngⅡ介導(dǎo)的超氧陰離子的產(chǎn)生，從而減少NO的分解;同時(shí)，ACEI可降低內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡水平，從而緩解肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的障礙，改善內(nèi)皮功能，達(dá)到肺保護(hù)的作用。此外，ACEI藥物如卡托普利抗氧化損傷作用也被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)同，Ghazi-Khansari等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，卡托普利是較強(qiáng)的氧自由基清除劑，此作用與其結(jié)構(gòu)上的巰基(-SH)作用有關(guān)。巰基具有抗氧化或吞噬氧自由基的功能，類似于內(nèi)源性氧自由基捕捉劑谷胱甘肽，從而具有抑制氧化應(yīng)激的作用。

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