瘤胃微生物對牧草纖維降解的研究進展

揚州大學動物科技學院 徐 俊 侯玉潔 史仁煌＊ 劉 紅 楊宏波 趙國琦

中國飼料工業(yè)協(xié)會 丁健

揚州大學試驗農牧場 朱建明

上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司 蘇衍菁

牧草對反芻動物來說必不可少，其經瘤胃發(fā)酵形成揮發(fā)性脂肪酸可為反芻動物提供70%～80%的能量，牧草纖維還對維持腸道健康和發(fā)揮最大生產潛力具有重要作用。然而，粗飼料在瘤胃中的降解率是決定其飼喂價值的關鍵因素（Sun，2006）。 植物形態(tài)、 結構 （Wilson和 Hatifield，1997）、 細胞壁組分 （Sun，2006）， 動物咀嚼行為（Pan 等，2003）和瘤胃內環(huán)境（Miron 等，2001）等因素均會影響牧草纖維的消化。研究表明，提高粗飼料降解率不但可以提高動物生產性能，還能減少營養(yǎng)物質流向環(huán)境造成浪費和污染 （Jung等，2011）。纖維的降解依賴于瘤胃內棲息的大量微生物，包括細菌、真菌和原蟲等（Dijkstra和Tamminga，1995），它們共同作用將牧草纖維逐漸降解。本文主要介紹了瘤胃微生物對牧草的降解及影響纖維降解的因素。

1 瘤胃微生物對牧草纖維的降解

奶牛采食的粗飼料先經咀嚼和反芻作用將粗飼料變短，然后經瘤胃微生物進一步降解，微生物的降解作用是決定粗飼料降解率高低的關鍵因素。瘤胃中微生物主要包括細菌、真菌和原蟲，細胞壁降解的80%由瘤胃中細菌和真菌完成，原蟲的作用僅占 20%（Sun等，2007）。

1.1 細菌對牧草纖維的降解 在瘤胃中，黃色瘤胃球菌（R.flavefaciens）、白色瘤胃球菌（R.albus）和產琥珀酸絲狀桿菌（F.succinogenes）是公認的分解纖維的三種優(yōu)勢菌，它們對植物細胞壁的降解作用已通過電子顯微鏡觀察得到了充分證實（Jung 和 Engels，2001）。 瘤胃中 88%～91%的葡糖糖內切酶和木聚糖酶，70%的淀粉酶和75%的蛋白酶是由飼料顆粒中緊密吸附的微生物分泌（Koike 等，2003），因此，與飼料顆粒緊密吸附的細菌對纖維的降解起主要作用（Miron等，2001）。

瘤胃細菌對飼料顆粒的吸附和降解作用因牧草種類而不同（Sun，2006；Akin，1989）。 以黑麥草為研究材料的試驗中發(fā)現(xiàn)，細菌可快速吸附于黑麥草上，15 min后細菌總數可達峰值（Edwards，2007）。黃色瘤胃球菌主要定植于黑麥草的表皮、薄壁組織和韌皮部邊緣（Latham等，1978）。以羊茅草和鴨茅草為研究材料的試驗中發(fā)現(xiàn)，羊茅草葉中不同組織部位的降解率不同，葉肉細胞和韌皮部纖維要比外周維管束鞘和表皮組織優(yōu)先降解，表皮和薄壁組織可完全被降解，植物組織類型的不同會改變微生物吸附的種類和數量，黃色瘤胃球菌不易附著在葉肉組織細胞和木質部導管中（Sun等，2007），此外，羊茅草中纖維分解菌有70%是產琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌（Cheng等，1984），它們可占細菌總數的0.1%～6.6%和 1.3%～2.9%（Krause 等，1999）。Shinkai和Kobayashi（2007）通過熒光原位雜交和實時熒光定量PCR的方法研究了產琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌對鴨茅草的定植作用，產琥珀酸絲狀桿菌可緊密吸附于橫斷面邊緣及未降解的內部組織，黃色瘤胃球菌要比產琥珀酸絲狀桿菌更傾向于吸附在葉鞘組織中，黃色瘤胃球菌對鴨茅草的降解起主導作用，其在瘤胃中的數量更多且降解莖桿的能力更強。Koike等（2003）通過競爭性PCR和尼龍袋法研究了綿羊中三種主要纖維降解菌對鴨茅莖的吸附和降解情況，結果表明，三種纖維分解菌的數量隨時間的延長逐漸升高，且在24 h時產琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌的數量達到峰值，分別為109cfu/g干物質和107cfu/g干物質，而白色瘤胃球菌在48 h達到峰值，為106cfu/g干物質。莖中中性洗滌纖維降解率隨時間的延長不斷提高，這與細菌數量的變化趨勢并非一致，可能是因為纖維酶活性滯后造成的。在鴨茅莖桿中吸附的細菌數量為產琥珀酸絲狀桿菌>黃色瘤胃球菌>白色瘤胃球菌，這與瘤胃食糜中三種細菌的數量相吻合。產琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃食糜和牧草莖桿降解中最重要的細菌。

在對秸稈的研究中發(fā)現(xiàn)，當瘤胃中pH為6.0時，吸附在大麥秸稈中的細菌量可達峰值，且黃色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌吸附量會達到飽和狀態(tài)，分別為33 mg/g干物質和23 mg/g干物質，它們在大麥秸稈中的吸附位點各不相同（Bhat和o/rskov，1990）。而將玉米秸稈機械破碎后發(fā)現(xiàn)，吸附于玉米秸桿上的纖維素分解菌和半纖維素分解菌的數量均得到顯著提高，這更有助于秸稈的消化（Kozakai等，2007）。

1.2 真菌對牧草纖維的降解 真菌可穿透牧草的角質層屏障降解無法被細菌和原蟲降解的木質化組織（Akin，1989），但真菌對低木質化組織的降解能力有限（Hobson 和 Stewart，1997）。 Wilson 和Hatfield（1997）研究指出，真菌可以減弱植物纖維組織的內部張力，使其變得疏松而易被瘤胃中微生物降解，雖然瘤胃中真菌遠不及細菌多，但是真菌可以優(yōu)先深入到植物纖維組織內部促進細菌的進一步降解（Varga和Kolver，1997）。真菌可以分泌多種降解植物細胞壁的酶，其中活性最高的是纖維素酶和木聚糖酶（Sun等，2007）。

瘤胃真菌可降解植物中的大部分多糖，并能溶解植物片段（Akin，1994）。研究發(fā)現(xiàn)，在體外純培養(yǎng)中有40%～45%的麥秸片段干物質在4 d內消失，而約50%的纖維素和半纖維素被消化，約16%的木質素也被損失。瘤胃真菌還有水解蛋白質的能力，而纖維分解細菌則無此功能，真菌的假根可穿透植物組織的蛋白層，而這一層阻止了纖維菌進入細胞壁（Wallace 和 Joblin，1985）。

Karunanandaa等（1995）研究發(fā)現(xiàn)，用白腐真菌處理稻草的莖和葉，其體外干物質消化率可分別提高13%和30%，真菌處理造成維管束鞘崩裂，使微生物更易接觸而促進葉肉組織的消化。Edwards等（2008）研究表明，黑麥草在瘤胃中培養(yǎng)5 min時即可發(fā)現(xiàn)真菌的存在，樣品處理方法并不會影響真菌的定植。

1.3 原蟲對牧草纖維的降解 研究表明，瘤胃中缺乏原蟲時，細胞壁在瘤胃中的降解率下降（Williams和 Coleman，1992）， 且在原蟲中發(fā)現(xiàn)有纖維酶的存在（Wang 和 McAllister，2002），因此，原蟲也被認為在植物細胞壁的降解過程中發(fā)揮著重要作用（Sun等，2007）。目前研究最多的分解纖維素的原蟲是真雙毛屬原蟲（Eudiplodinium maggii），單個蟲體可以吞噬148 ng的纖維素，它的消化速率達到 320 pg/min（Coleman，1992）。 除了內毛屬原蟲（Entodinium spp）以外，在所有內毛蟲目（Entodiniomorphid）的原蟲體內均含有纖維素酶，且纖維素酶活性最高的原蟲是Eudiplodinium maggii、Epidinium ecaudatum caudatum 和 Ostracodinium obtusum bilobum。然而，由于原蟲在體外很難培養(yǎng)和存活，因此，有關原蟲對纖維降解作用的研究受到一定限制，有待于進一步深入探討。

2 影響纖維消化的因素

2.1 動物采食、日糧處理和飼喂方式 動物采食、日糧處理、飼喂方式等均會影響微生物的生長和底物纖維的消化（Varga和Kolver，1997）。動物采食會影響瘤胃液和內容物的周轉速率，而結構性碳水化合物的降解速率與食糜流通速率有關，且隨動物采食量的提高而降低 （Russell等，1992）。將粗飼料粉碎和制粒后，纖維素酶與牧草的接觸面積增大更易于微生物的降解。氨化或堿處理牧草可溶解半纖維素和木質素，進而提高牧草消化率（Fahey等，1993）。另外，日糧的飼喂形式和飼喂頻率也會影響纖維的消化，飼喂營養(yǎng)物質均衡的全混合日糧、易發(fā)酵日糧，以及少量多次飼喂，均可促進瘤胃內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，提高纖維分解菌的數量以及纖維消化率（Robinson，1989）。

2.2 微生物因素 細菌與底物的吸附能力是影響底物消化率的重要因素，也是植物細胞壁多糖降解的前提條件 （Fernando等，2012；Lynd等，2002）。微生物與底物的吸附可以在細胞和分子水平上影響其生理生化反應（R·oper和 Koch，1988）。

細菌間存在競爭關系，并會相互抑制與底物的吸附（Fernando等，2012）。當產琥珀酸絲狀桿菌與瘤胃球菌同時存在時，產琥珀酸絲狀桿菌的吸附數量明顯受到抑制，這可能是與球菌黏附快而產琥珀酸絲狀桿菌黏附慢有關。當產琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌完成與底物的吸附后，添加白色瘤胃球菌并不影響其吸附，但出現(xiàn)部分已黏附的黃色瘤胃球菌的脫落，這可能是因為這兩種球菌的黏附位點相同或在黏附過程中相互抑制所致，而球菌和產琥珀酸絲狀桿菌的黏附位點不同（Mosoni等，1997）。當原蟲與細菌或真菌共培養(yǎng)時，細胞壁的降解速度較各微生物單獨培養(yǎng)時低，但真菌與細菌共培養(yǎng)時，出現(xiàn)互作效應，從而提高細胞壁降解率（Lee等，2000）。

底物中微生物密度會影響其對纖維的吸附能力，高密度環(huán)境下，細菌間的競爭則會嚴重影響對纖維的吸附和消化（Fernando等，2012）。某些細菌釋放的多肽物質和累積的產物也會抑制微生物的吸附 （Pettipher和Latham，1979）。 細菌表面糖蛋白質也會影響細菌的吸附能力，當細菌表面糖蛋白變性或構象改變時，細菌對底物的吸附能力明顯降低。當用高碘酸鹽、戊二醛和蛋白酶去除產琥珀酸絲狀桿菌表面的糖蛋白后，該菌與底物的黏附數量顯著降低（Gong和Forsberg，1989）。然而，用疊氮化鈉或甲醛殺死細菌，對細菌的黏附能力無影響，但是用加熱的方法（蛋白完全變性）可以強烈的抑制細菌的黏附能力（Roger等，1990）。

2.3 底物因素 植物組織結構、細胞壁組分及其結構等均會影響纖維的消化，大多數植物表皮存在一層蠟質和角質層，阻止了微生物對粗飼料的黏附。瘤胃細菌通常是通過對氣孔、皮孔或植物破損部位的入侵到達植物組織的內部進行對植物組織的進一步消化和降解 （McAllister等，1994）。與此同時，底物大小和形狀也會影響微生物的吸附，飼料顆粒的表面積越大越有利于微生物對纖維的降解，因為瘤胃微生物可以更好地入侵到植物的內部進行附著和分泌纖維降解酶。反芻動物在進食時對粗飼料的咀嚼作用，可破壞粗飼料表皮的角質層，增大吸附表面積，暴露出更多的可消化位點供微生物利用，從而有利于牧草纖維的降解（McAllister等，1994）。

2.4 環(huán)境因素 溫度的變化會顯著影響瘤胃微生物的吸附能力。研究表明，產琥珀酸絲狀桿菌在4、22℃和37℃條件下，對微晶纖維素的黏附率分 別 為 50%、79%和 82%（Gong和 Forsberg，1989）。在50℃以上時，白色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌的黏附率會降低，白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌的黏附率均在 30～38 ℃時最大（Roger等，1990）。

pH對纖維分解菌的吸附作用的影響因不同細菌而異。對于產琥珀酸絲狀桿菌，當pH由4.5上升到6時，該菌對底物的黏附力有所增加；當pH為6～7時，該菌的黏附力保持穩(wěn)定；當pH大于7.5時，該菌的黏附力會急劇下降。對于黃色瘤胃球菌，當pH為3.3～7.5時，該菌的黏附力較穩(wěn)定；當pH上升到8時，該菌的黏附力會逐漸下降。對于白色瘤胃球菌，當pH為5.5～8時，該菌的黏附力不受影響（Roger等，1990）。

底物中離子種類和濃度也會極大地影響瘤胃微生物的吸附。提高底物中Ca2+或Mg2+濃度時，產琥珀酸絲狀桿菌對纖維的黏附作用會顯著提高（Gong和 Forsberg，1989）。但 Roger等（1990）研究認為，產琥珀酸絲狀桿菌對二價陽離子并不敏感，Na+對其黏附能力的影響更大。黃色瘤胃球菌的黏附能力并不單獨受Ca2+、Mg2+或Na+的影響，不過當同時缺少兩種二價陽離子時，黏附作用則會顯著降低。

3 展望

牧草中的結構性碳水化合物是反芻動物重要的能量來源，而纖維的降解是影響牧草營養(yǎng)價值的關鍵因素，瘤胃中微生物對不同牧草的降解規(guī)律存在一定的差異，因此，明確瘤胃微生物對不同牧草的降解機制對合理利用牧草纖維至關重要。雖然，目前關于牧草纖維降解機制的研究已取得一定進展，但仍然有諸多問題尚未解決，如對不同牧草結構性碳水化合物瘤胃內降解機制、代謝轉化途徑、營養(yǎng)調控功能，以及對乳品質、肉質調控影響的研究還有待深入。與此同時，利用現(xiàn)代基因工程技術、蛋白質工程等方法，開展纖維分解菌和低木質化牧草育種以及新型高效纖維素酶的開發(fā)也將更有助于促進牧草在畜牧生產中的高效利用。

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