學習記憶訓練對全腦缺血大鼠認知能力的影響

張軍艷 栗延偉 任玉琴 譚 軍

新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科 新鄉(xiāng) 453003

本研究通過建立全腦缺血大鼠模型，觀察電迷宮訓練對全腦缺血大鼠空間辨別能力的影響，并觀測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain－derived neurotrophic factor，BDNF）的變化，探討其可能的作用機制，進而為臨床上對患者進行學習記憶訓練改善血管性認知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）患者的認知功能提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 健康成年雄性SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量（290±40）g，由河南省實驗動物中心提供。免疫組化試劑盒由北京中山生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實驗動物的篩選及分組 大鼠經(jīng)Y型迷宮測試，將大鼠放入Y型迷宮箱中適應3～5min后，給予適當電擊，至其對3臂均探索進入為止，選擇活躍、對電擊反應較敏感、逃避反應迅速的大鼠進行訓練。淘汰掉反應過于遲鈍或特別敏感的大鼠。預選出達到連續(xù)2次正確反應，電擊次數(shù)≤3次，對電擊反應較敏感的大鼠供實驗用。在上述初步篩選的基礎(chǔ)上，通過正式迷宮訓練4～7d，淘汰達不到學會標準（學不會）的大鼠。將達到學會標準的90只大鼠隨機分成3組：假手術(shù)組、對照組和訓練組，每組30只。

1.3 全腦缺血模型制備 采用改良的Pulsineli 4血管閉塞法制作全腦缺血大鼠模型［1］。假手術(shù)組除不電凝椎動脈、不夾閉雙側(cè)頸總動脈外，其余過程與手術(shù)組相同。造模術(shù)后1周，對大鼠進行電迷宮測試，20次／d，連續(xù)3d，平均錯誤次數(shù)≥8次作為模型鼠認知障礙的判定標準。造模成功后，根據(jù)訓練時間的不同將各組再分為7d、14d和21d3組，分別編號、稱質(zhì)量及分籠飼養(yǎng)，每個時間點10只。

1.4 學習記憶訓練 采用Y型電迷宮進行學習記憶能力訓練。采用固定次數(shù)隨機不休息法［2］，每輪固定訓練20次。每天訓練兩輪（08：00和20：00），連續(xù)訓練21d。分別在訓練的7d、14d、21d對大鼠進行檢測，連測3d取平均值記錄每只大鼠錯誤反應次數(shù)、全天總反應時間和潛伏期。

1.5 HE染色和免疫組織化學染色 各組大鼠分別于訓練的第7、14、21天進行學習記憶測試后斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，片厚5μm。部分石蠟切片常規(guī)脫蠟及水化處理后，行蘇木素－伊紅（HE）染色，二甲苯常規(guī)脫水后中性樹脂封片，光鏡下觀察腦組織細胞形態(tài)學變化。另取部分石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水化行免疫組織化學染色。陰性對照用PBS代替一抗。通過彩色圖文分析系統(tǒng)，在400倍物鏡下每組隨機選取5張切片。在每個海馬CA1區(qū)分別選擇5個相鄰的視野攝取圖像傳遞至計算機顯示屏，分析各組BNDF免疫陽性神經(jīng)元的平均光密度值以反映BNDF表達的強弱。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點學習記憶能力測試結(jié)果 術(shù)前各組大鼠的學習能力一致，均達到學會標準，錯誤反應次數(shù)為1.00±0.82，全天總反應時間（89.08±19.07）s，潛伏期（4.45±1.69）s。

訓練7d后，與假手術(shù)組比較，對照組學習記憶能力明顯減退，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，訓練組學習記憶能力改善明顯（P＜0.05）；與假手術(shù)組比較，訓練組全天總反應時間和潛伏期延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），錯誤反應次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

訓練14d和21d時，與假手術(shù)組比較，對照組學習記憶能力進一步減退。與對照組比較，訓練組學習記憶能力進一步改善，各項測試指標差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。訓練21d時，與假手術(shù)組比較，訓練組錯誤反應次數(shù)和潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），全天總反應時間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1、2。

2.2 HE染色觀察結(jié)果 低倍鏡下：假手術(shù)組大鼠海馬錐體細胞層結(jié)構(gòu)緊密，層次豐富。對照組大鼠海馬神經(jīng)元明顯受損，CA1區(qū)細胞排列稀疏，細胞線不清晰。訓練組神經(jīng)元排列較對照組稍整齊。高倍鏡下：假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)規(guī)則，略呈錐形，核呈圓形或橢圓形，核膜清楚，核質(zhì)染色均勻。對照組和訓練組神經(jīng)元可見胞體縮小，胞漿嗜酸性，胞核固縮或溶解。在相應時間點進行神經(jīng)元計數(shù)，訓練7d后，與假手術(shù)組比較，對照組和訓練組細胞核完整的神經(jīng)元明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。訓練14d和21d后，與對照組比較，訓練組神經(jīng)細胞較對照組明顯增多（P＜0.05），與假手術(shù)組比較，訓練組神經(jīng)細胞數(shù)仍較少（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)比較

2.3 各組不同時間點海馬CA1區(qū)BNDF表達的光密度值比較 光鏡下可見BDNF免疫陽性顆粒主要分布在海馬CA1、CA3、DG區(qū)，呈圓形或橢圓形，大小不一，以胞漿著色為主，陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀，部分細胞可見的陽性反應突起。假手術(shù)組BDNF免疫陽性神經(jīng)元相對較少，著色較淺淡。陰性對照用PBS代替一抗，未見陽性產(chǎn)物。訓練7d后，與假手術(shù)組比較，訓練組和對照組海馬CA1區(qū)BDNF光密度值升高（P＜0.05）。訓練14d后，訓練組BDNF光密度值升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。訓練21d后，訓練組BDNF光密度值進一步升高，與對照組和假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組海馬CA1區(qū)BNDF免疫陽性神經(jīng)元結(jié)果比較 （）

表1 3組海馬CA1區(qū)BNDF免疫陽性神經(jīng)元結(jié)果比較 （）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05，與對照組比較，＊P＜0.05

組別 光密度值7d 14d 21d訓練組 2.0917±0.7656＃ 9.3721±0.8974＃＊ 15.3176±0.8129＊對照組 1.3062±0.4423＃ 6.7289±0.7427＃ 4.9877±0.6075＃假手術(shù)組0.7183±0.5519 0.7029±0.5421 0.7146±0.4271

3 討論

目前已知的與人類認知功能關(guān)系密切的大腦組織結(jié)構(gòu)主要有海馬、杏仁體以及額顳葉皮層等，其中海馬及其周圍皮層結(jié)構(gòu)是記憶神經(jīng)通路的重要組成部分［3］，與人類的學習記憶功能關(guān)系最為密切。海馬直接參與了信息的儲存和回憶，且與空間定位的學習記憶有關(guān)，是學習記憶等高級神經(jīng)活動的重要部分。目前大量研究表明，康復訓練對于改善缺血性腦血管病的多種功能障礙有明顯的療效。康復訓練是影響腦功能恢復極為重要的因素。本實驗中應用Y型電迷宮檢測造模前各組大鼠的學習記憶能力一致，均達到學會標準。造模后7d對照組和訓練組學習記憶能力明顯減退，錯誤次數(shù)增多，全天總反應時間和潛伏期延長，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義。應用Y型電迷宮訓練，與假手術(shù)組比較，隨著訓練時間的延長，訓練組的學習記憶能力逐漸改善，而對照組的學習記憶能力逐漸減退，說明全腦缺血后可以造成大鼠的學習記憶能力障礙，而早期進行Y型電迷宮訓練可以改善全腦缺血大鼠的學習記憶能力。

BDNF作為神經(jīng)營養(yǎng)家族成員之一，對多種神經(jīng)元具有分化、增殖、營養(yǎng)、成熟的作用，具有增強突觸聯(lián)系、增加學習記憶的功能。有關(guān)記憶的研究表明，記憶與突觸前和突觸后的長時程增強效應（long－term potentiation，LTP）明確相關(guān)，BDNF能調(diào)節(jié)突觸傳遞和突觸可塑性，改變LTP［4］，增強學習記憶功能，因此在研究中將BDNF作為記憶改善的分子標志物。研究發(fā)現(xiàn)應用 Morrsi水迷宮測試BDNF基因敲除的小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠存在學習記憶能力缺損［5］。腦缺血損傷后可促進BDNF的升高，從而形成腦缺血后自我保護機制，但BDNF的升高持續(xù)時間短暫，有研究發(fā)現(xiàn)康復訓練亦可促進腦缺血后BDNF升高，袁學謙等［6］對急性腦梗死患者進行早期康復訓練后，患者血清BDNF、NGF含量治療后較治療前明顯升高，且神經(jīng)功能缺損程度明顯減少。王風波等［7］對腦損傷仔鼠采用電針聯(lián)合豐富康復訓練進行干預28d后，發(fā)現(xiàn)干預組仔鼠腦皮質(zhì)BDNF陽性表達明顯高于對照組和非干預組仔鼠。本研究發(fā)現(xiàn)全腦缺血大鼠對照組和訓練組較假手術(shù)組海馬CA1區(qū)BDNF表達均增加，但隨著訓練時間延長，對照組BDNF表達有下降趨勢，但訓練組BDNF的表達較對照組明顯增加，同時電迷宮測試結(jié)果提示訓練組大鼠的空間學習記憶能力明顯改善。因此，學習記憶訓練可以通過增加BDNF，保護海馬神經(jīng)元免受進一步損害，或?qū)σ咽軗p的神經(jīng)元修復有促進作用，從而促進全腦缺血大鼠空間記憶能力的改善。

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［6］袁學謙，王艷，張莉峰，等 .早期康復訓練對急性腦梗死患者血清BDNF、NGF含量及神經(jīng)功能缺損程度的影響［J］.中國實用神經(jīng)疾病雜志，2010，13（22）：38－39.

［7］王風波，唐明薇，李曉捷 .電針聯(lián)合豐富康復訓練對腦損傷仔鼠腦皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響［J］.中國康復理論與實踐，2012，8（18）：717－720.