農(nóng)產(chǎn)品中青霉素殘留檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

陳卓婧，閻淑男，夏 瀾，龔云飛

(中國計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計(jì)量與檢驗(yàn)檢疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310018)

1 青霉素簡介及應(yīng)用

青霉素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，最初從青霉菌培養(yǎng)液中提取而得，分子中含有青霉烷。青霉素的作用機(jī)理是干擾細(xì)胞壁的合成，使細(xì)菌失去細(xì)胞壁保護(hù)，從而由于菌體胞漿滲透壓高，外界水分不斷滲入致使其膨脹、變形、破裂而死亡。當(dāng)前，常用的幾種青霉素有氨芐青霉素、青霉素G以及青霉素鹽等，以其高效、價(jià)廉而成為獸醫(yī)臨床和人類醫(yī)療使用較普遍的抗生素之一［1］。

2 青霉素的濫用及危害

青霉素高效低毒，且成本低，在臨床上發(fā)揮了重要作用，能夠治療細(xì)菌性感染。然而，目前青霉素濫用于預(yù)防感染的現(xiàn)象廣泛存在。如當(dāng)前青霉素在用于預(yù)防休克、昏迷、農(nóng)藥中毒、腦卒中、心力衰竭等繼發(fā)性感染時(shí)，其結(jié)果已經(jīng)不能使繼發(fā)感染減少，其原因?yàn)榛颊吣退幘灰卓刂?，通常為感染?xì)菌［2］。據(jù)國內(nèi)某醫(yī)院統(tǒng)計(jì)，對(duì)昏迷患者應(yīng)用抗生素預(yù)防治療，43.7%的患者發(fā)生肺炎，而未用抗生素的患者僅20%繼而發(fā)生肺炎［3］。另外，在闌尾切除手術(shù)中，加強(qiáng)無菌操作但未用抗生素者，無術(shù)后感染現(xiàn)象;而應(yīng)用抗生素的患者有16.7%發(fā)生傷口感染，7.8%發(fā)生肺部感染、尿路感染等，研究表明，致病菌多為耐藥菌［4］。

濫用青霉素有可能引發(fā)過敏性休克。如患者因患感冒濫用青霉素、皮試陰性、肌注后發(fā)生青敏休克、誤診為暈針等，因耽誤搶救而死亡［4］。

青霉素與鏈霉素聯(lián)用將增大中毒性耳聾發(fā)生率。一遇到細(xì)菌感染，就把青、鏈霉素作為各種感染的首選配方來使用，危害極大，很可能產(chǎn)生致聾等不良后果［5］。

鑒于青霉素的潛在危害，為有效規(guī)范青霉素類藥物在醫(yī)療和畜牧業(yè)中的應(yīng)用，各國或地區(qū)對(duì)青霉素的最大殘留限量 (MRL)作了明確規(guī)定。美國FDA規(guī)定，青霉素類抗生素在各類農(nóng)產(chǎn)品中的MRL不超過5μg·kg-1。歐盟對(duì)牛奶中青霉素的MRL規(guī)定:青霉素G 40μg·L-1，苯唑青霉素、鄰氯青霉素、雙氯青霉素均為30μg·L-1。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定，氨芐青霉素在可食用動(dòng)物組織中的MRL均為50 μg·kg-1。

3 青霉素殘留檢測(cè)方法

目前，青霉素殘留檢測(cè)方法可歸納為以下幾類:微生物法、儀器分析法 (包括高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜法等)、免疫分析法 (如酶聯(lián)免疫分析法和免疫傳感器等)以及基于受體技術(shù)的分析法。

3.1 微生物法

目前國內(nèi)外常用的青霉素殘留檢測(cè)的微生物學(xué)檢測(cè)方法有微生物抑制法和微生物受體法。

3.1.1 嗜熱脂肪芽胞桿菌紙片法

該法的測(cè)試菌株采用嗜熱脂肪芽胞桿菌，培養(yǎng)溫度為35～75℃。為摒除潛在的干擾物質(zhì)，需要對(duì)牛奶樣品進(jìn)行 (82±2)℃的加熱處理。研究顯示，3～4 h可獲得檢測(cè)結(jié)果，最低檢測(cè)限達(dá)到4 ng·mL-1［6］。該法的檢測(cè)限和準(zhǔn)確性滿足我國農(nóng)業(yè)部對(duì)青霉素類殘留的限量要求，且檢測(cè)成本低，適合基層單位的常規(guī)檢測(cè)。

3.1.2 CHARM II法

需要采用放射性元素先標(biāo)記目標(biāo)物的方法［6］。先采用3H或14C標(biāo)記青霉素，讓其與牛奶中殘留的青霉素競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌表面的特異性受體位點(diǎn)，而樣品的放射強(qiáng)度與樣品的殘留物的含量成反比，所以通過比較其與判定點(diǎn)的放射性強(qiáng)度得出青霉素殘留量。CHARM II法的檢測(cè)限為2 ng·mL-1，檢測(cè)時(shí)間短至15 min。該法以其短時(shí)高效、簡便靈敏見長，但成本較高。

3.2 儀器分析法

3.2.1 高效液相色譜法 (HPLC)

HPLC法采用Hypersil ODS柱(200 mm×4.6 mm，5μm)，以0.02 mol·L-1的磷酸二氫鉀緩沖液 (磷酸調(diào)pH值至3.5)-甲醇 (65∶35)為流動(dòng)相，紫外檢測(cè)波長為220 nm。其結(jié)果顯示，青霉素質(zhì)量濃度0.498 8～39.9040μg·mL-1，峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率為99.85%，RSD=0.50%。HPLC法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于青霉素菌絲體中微量青霉素殘留的檢測(cè)［7］。

Xie等［8］采用反相液相串聯(lián)熒光檢測(cè)器法同時(shí)測(cè)定雞蛋中的阿莫西林 (AMO)和氨芐青霉素(AMP)。該法先用簡單的液-液萃取方法 (乙腈∶二氯甲烷)對(duì)樣品進(jìn)行萃取，接著用水楊酸與AMO和AMP反應(yīng)產(chǎn)生熒光衍生物，流動(dòng)相采用0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀，再采用熒光檢測(cè)器法分析該衍生物。AMO和AMP在5.0～800.0 ng·mL-1，檢測(cè)結(jié)果具良好的線性關(guān)系，回收率為77.6%～88.7%，最低檢出限分別為1.2和0.4μg·kg-1，最低定量限分別為3.9和1.5μg·kg-1。經(jīng)試驗(yàn)得出，其相應(yīng)的日內(nèi)及日間變異 (相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)分別小于9.6%和14.8%，變異系數(shù)控制在10%左右。

3.2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (HPLC-MS)

HPLC-MS法是將樣品中青霉素經(jīng)磷酸二氫鈉液提取，加正己烷去除脂肪后，過SPE柱，乙腈洗脫，氮?dú)獯蹈?，用乙?水 (1∶1，V∶V)定容至1 mL，過膜后采用Agilent Eclipse P1us C18柱高效液相色譜分離，電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，負(fù)離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量?？傻媒Y(jié)果加標(biāo)水平為5.0，10.0和20.0μg·kg-1時(shí)，回收率在73.58%～101.18%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.00%～8.82%，儀器檢出限為0.1μg·L-1，方法的定量限均為5.0μg·kg-1。該法操作簡單、準(zhǔn)確性高，可滿足對(duì)動(dòng)物肺組織中青霉素G和青霉素V殘留的定量分析要求［9］。

3.3 免疫分析法

3.3.1 酶聯(lián)免疫分析法

Samsonova等［10］采用間接ELISA法對(duì)牛奶中的氨芐青霉素進(jìn)行定量分析研究。首先采用活性酯法抗原，再通過動(dòng)物免疫獲得多克隆抗體。交叉反應(yīng)結(jié)果顯示，與阿洛西林、青霉素G、哌拉西林和羧芐青霉素的交叉反應(yīng)率分別為17%，10%，5%和10%。繼而建立的間接ELISA法實(shí)現(xiàn)了牛奶樣品中氨芐青霉素5 ng·mL-1的最低檢出限。

姜侃等［11］通過制備辣根過氧化物酶標(biāo)記氨芐青霉素的偶聯(lián)物，采用方陣滴定法選擇抗氨芐青霉素抗體最佳包被濃度。在最佳工作濃度下，通過直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算靈敏度，統(tǒng)計(jì)非β-內(nèi)酰胺類抗生素交叉反應(yīng)率，最后定量分析乳品中的β-內(nèi)酰胺類抗生素。結(jié)果表明，對(duì)于陰性和陽性牛奶樣品的檢測(cè)未出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。該法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可廣泛應(yīng)用于乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測(cè)。

3.3.2 免疫傳感器

免疫傳感器技術(shù)是將高靈敏度的傳感技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)結(jié)合起來，從而建立用以監(jiān)測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的生物傳感器［12］。測(cè)定青霉素殘留的方法一般為電化學(xué)免疫傳感器。Knecht等［13］將多殘留分析技術(shù)與平行親和傳感器聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了牛奶中10種抗生素殘留的自動(dòng)檢測(cè)，其中青霉素G的檢測(cè)結(jié)果滿足規(guī)定的MRL要求。

3.4 其他方法

3.4.1 化學(xué)發(fā)光分析法

是將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與流動(dòng)注射技術(shù)聯(lián)用從而建立快速廉價(jià)的檢測(cè)方法。Chivulescu等［14］采用此技術(shù)分析3種β-內(nèi)酰胺抗生素:阿莫西林、氨芐青霉素和青霉素G。該研究的新穎之處在于對(duì)目標(biāo)樣品進(jìn)行放射性處理，從而使在線檢測(cè)效果放大10～350倍。研究結(jié)果顯示，氨芐青霉素和青霉素G的有效檢測(cè)范圍為0.05～100.00μg·L-1，阿莫西林的有效檢測(cè)范圍為0.25～100.00μg·L-1。該法操作簡單，成本低廉，重現(xiàn)性好，可滿足對(duì)此類抗生素的檢測(cè)需要。

3.4.2 適配子法

Song等［15］采用適配子技術(shù)對(duì)青霉素的檢測(cè)開展了研究。該方法采用基于熒光雙色法的納米金標(biāo)記單鏈寡核苷酸。經(jīng)過篩選，適配子 AMP4，AMP17和AMP18對(duì)氨芐青霉素具有較高的靈敏度和特異性。在牛奶樣品的試驗(yàn)中，檢測(cè)結(jié)果顯示，基于熒光法和比色法的檢測(cè)，其最低檢測(cè)限分別為2和10 ng·mL-1，低于規(guī)定的最大殘留標(biāo)準(zhǔn)。因此該法也能用于氨芐青霉素殘留的研究。

3.4.3 基于受體技術(shù)的分析法

Cacciatore等［16］研究了一種基于SPR的檢測(cè)牛奶中青霉素和頭孢菌素殘留的生物傳感器。該法通過對(duì)樣品的特殊前處理，成功消除了因?yàn)椴煌瑯悠穾淼幕|(zhì)效應(yīng)影響。研究結(jié)果顯示，牛奶中青霉素的最大殘留檢測(cè)值為4μg·L-1。

Lamar等［17］從肺炎鏈球菌中提取出的青霉素結(jié)合蛋白PBP 2X*，采用一種更新穎的抗原標(biāo)記技術(shù)，建立了用來檢測(cè)各類食品中的β-內(nèi)酰胺類物質(zhì)殘留的方法。該法可用于定量檢測(cè)牛奶、不同動(dòng)物肉汁、雞蛋和蜂蜜中的頭孢哌酮、頭孢喹肟、頭孢唑啉、鄰氯青霉素、氨芐青霉素和青霉素G，其最低檢出限可達(dá)2μg·kg-1。該法具有不需復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程且省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)。

4 小結(jié)

青霉素類抗生素是人類對(duì)抗細(xì)菌性感染的一大武器，但由于過量攝入青霉素，體內(nèi)病菌經(jīng)過自然選擇，抗藥性逐漸增強(qiáng);同時(shí)殘留在動(dòng)物性食品中(主要為牛奶)的青霉素類藥物會(huì)通過富集作用對(duì)人體、環(huán)境造成難以估量的危害。所以建立對(duì)青霉素殘留的有效精確監(jiān)測(cè)具有重要意義。微生物法操作簡單，主要用于定性檢測(cè)，不能滿足精確的定量分析，且分析時(shí)間長;儀器分析法精確，但對(duì)操作人員專業(yè)要求高，且樣品前處理煩瑣;免疫分析技術(shù)靈敏度高，可用于陽性樣品的大量篩選，但其抗原抗體制備難度大。因此建立同時(shí)具備靈敏度高、操作簡便快捷、分析成本低、前處理簡化、儀器化程度低、通量高等優(yōu)點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù)迫在眉睫?；谑荏w結(jié)合的分析技術(shù)在一定程度上彌補(bǔ)了以上不足，因此在青霉素殘留檢測(cè)技術(shù)值得予以重視。該法的關(guān)鍵在于受體的獲得。一般有2種方式:一種是天然提取，即大量培養(yǎng)目標(biāo)微生物，然后提取。簡單易操作，但存在雜蛋白多，目標(biāo)蛋白含量少的缺點(diǎn)。另一種是克隆表達(dá)。該法雖技術(shù)要求高，但一旦建立，目標(biāo)蛋白就能大量源源不斷獲得，對(duì)于建立相關(guān)殘留的檢測(cè)方法非常方便，值得重視和研究。

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