水稻紋枯病菌毒素研究進(jìn)展

李 路，王 玲，劉連盟，孫 磊，黃世文

(1.中國水稻研究所，浙江杭州 310006;2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530003)

水稻紋枯病在全球普遍發(fā)生，是我國水稻3大病害之一，嚴(yán)重時(shí)可致水稻減產(chǎn)50%［1］。水稻紋枯病的發(fā)生主要與品種耐病性、形態(tài)特征、種植制度、氮肥用量以及氣象要素等有關(guān)［2］。

真菌毒素由植物病原真菌產(chǎn)生，在植物病害的發(fā)生、發(fā)展過程中具有明顯的致病、致毒作用，對植物組織也有明顯的損害作用［3-4］。水稻紋枯病是一種真菌性病害，它的致病菌為立枯絲核菌，具有強(qiáng)腐生性和較寬的寄主范圍［5］。本文對紋枯病菌毒素的提純方法、組分分析、毒害和致病機(jī)理等方面進(jìn)行綜述。

1 紋枯菌毒素的提純

可供立枯絲核菌產(chǎn)毒的培養(yǎng)基較多。改良的Richard 培養(yǎng)基使真菌產(chǎn)毒最多［6］。徐敬友等［7］在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了產(chǎn)毒的培養(yǎng)條件:pH值為7.0的改良Richard培養(yǎng)基，于黑暗下培養(yǎng)15～20 d，溫度25～3 0℃，每天人工振蕩2～4次。

陳夕軍等［8］比較了活性炭吸附法、酸度調(diào)節(jié)萃取法、活性炭吸附萃取法和乙醚萃取法提純紋枯病菌毒素的優(yōu)劣，經(jīng)生物活性檢測，乙醚萃取法和活性炭吸附萃取法所得的紋枯病菌毒素毒性最強(qiáng)。Vidhyasekaran等［9］將水稻紋枯病菌培養(yǎng)濾液濃縮，加甲醇去沉淀、用活性炭吸附，過濾后的濾液用有機(jī)溶劑萃取，得到了粗毒素，再經(jīng)SephadexG-75硅膠柱兩次層析，也可得到較純的毒素。

2 紋枯菌精毒素的組分分析

真菌毒素的化學(xué)成分一般包括多糖、糖肽、酚類、雜環(huán)化合物、氨基酸衍生物、肽、類萜化合物以及脂類化合物等［10］。國內(nèi)說法不一，推測紋枯病菌毒素可能含有多種成分［5，8，10］。

1963年初次用色譜法推測紋枯病菌毒素的成分為苯乙酸及其衍生物［11］。其組分是間位羥基苯乙酸和間位甲氧基苯乙酸［9］。用高效液相色譜法檢測發(fā)現(xiàn)，水稻紋枯病菌毒素可能含有4種成分，紅外光譜分析顯示毒素組分中可能含有O—H或N—H，C—O，C—N或C O等基團(tuán);薄層色譜分析顯示毒素的Rf值與葡萄糖、半乳糖、甘露糖相近，表明毒素中很可能含有這3種糖類;氣質(zhì)聯(lián)用分析表明毒素組分中不含苯乙酸和苯甲酸等含苯環(huán)類物質(zhì)，主要含有蔗糖、葡萄糖和N-乙酰氨基甘露糖［5］，這與陳夕軍等的研究結(jié)果一致［8］。通常這些單糖不會(huì)對植物產(chǎn)生毒性，但它們可能作為某種組分參與構(gòu)成毒性物質(zhì)。至于毒素含有的具體是哪一種糖，含有什么活性基團(tuán)，尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3 紋枯菌粗毒素對水稻的毒害作用

用針刺接種法將紋枯病菌粗毒素接種到水稻葉鞘，接種部位出現(xiàn)了紋枯病典型的“云紋”癥狀［8］。粗毒素對水稻種子的發(fā)芽率、胚根和胚芽的生長也有明顯的抑制作用，且抑制率隨毒素濃度提高而增大，毒素濃度達(dá)1%時(shí)完全抑制了種子發(fā)芽，以及胚根和胚芽的生長［7］。

紋枯病菌毒素對水稻葉鞘和葉片的細(xì)胞膜都有顯著的損傷作用，它能導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的改變和細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外漏［7，10，12］。將毒素稀釋 5 ～ 10 倍，細(xì)胞膜的損傷率在80%以上，而且水稻抗、感病品種的葉鞘與葉片細(xì)胞膜對毒素的敏感性并無明顯差異。毒素還能使水稻組織中磷素外滲，并且葉鞘的磷素外滲率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于葉片［13］。用稀釋10倍的毒素處理，水稻葉綠素含量比對照減少85%，36 h后，葉綠體解體，其他細(xì)胞器也消解［10］。水稻葉綠素的含量與紋枯病菌毒素的濃度呈反比，且抗、感品種間無顯著差異［12］。

4 紋枯菌毒素的致病機(jī)理

對水稻紋枯病菌的致病機(jī)理有不少研究，但結(jié)論不一［11-17］。劉洪濤等［15］研究發(fā)現(xiàn)，菌株致病力與其體外產(chǎn)毒能力呈正相關(guān)，菌株的體外產(chǎn)毒能力越強(qiáng)，其致病力也越強(qiáng)。植物離體培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生一系列的酶，如纖維素酶、苯丙氨酸裂解酶，相關(guān)酶的活性越高毒力越高。董國強(qiáng)等［14］也發(fā)現(xiàn)，水稻紋枯病菌產(chǎn)生的纖維素酶會(huì)分解水稻組織的纖維素，并認(rèn)為這是造成水稻組織分解的原因。果膠酶是立枯絲核菌的致病因子，它產(chǎn)生的果膠酶活性與該菌的致病力有關(guān)［15］。水稻紋枯病菌所產(chǎn)生的纖維素酶和果膠酶含量均與致病性有密切關(guān)系，且果膠酶在病原菌侵染植株時(shí)起著先導(dǎo)作用，但半纖維素酶的產(chǎn)量與致病性的關(guān)系尚不能肯定，仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)［16］。Sriram 等［17］卻指出，果膠酶的活性與水稻紋枯病菌的致病性是無關(guān)的，病菌產(chǎn)生的毒素才是致病因子。而Lakpale等［18］則認(rèn)為水稻紋枯病菌產(chǎn)生的毒素在病原菌的致病過程中不起主要作用。陳夕軍等［13］認(rèn)為，毒素通過損傷水稻植株的細(xì)胞膜、降低葉綠素含量、對葉鞘細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)造成破壞以及誘導(dǎo)水稻組織磷素外滲使植株表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，組成細(xì)胞膜的類脂可能是毒素作用的位點(diǎn)，但具體是如何作用于細(xì)胞膜的還不清楚［16］。

5 紋枯菌粗毒素對水稻體內(nèi)代謝酶活性的影響

水稻紋枯病菌毒素侵染植株后會(huì)激活寄主體內(nèi)的防衛(wèi)系統(tǒng)，使防御相關(guān)酶的活性提高，從而增強(qiáng)水稻的抗病能力［12］。在紋枯病菌毒素處理水稻48 h后，水稻葉片內(nèi)過氧化物酶的活性有較大提高;當(dāng)毒素稀釋20倍時(shí)，葉片過氧化物酶的活性達(dá)最大值;稀釋20～100倍時(shí)，水稻植株的多酚氧化酶活性、葉片苯丙氨酸解氨酶的活性以及水稻植株葉片和葉鞘超氧化物歧化酶的活性也都明顯升高［10］。用紋枯病菌毒素處理水稻36 h后，植株體內(nèi)超氧化物歧化酶的活性達(dá)到最高，并且1～2 d內(nèi)能檢測到毒素誘導(dǎo)產(chǎn)生的5種新的SOD同工酶［18-19］。水稻植株多酚氧化酶的活性在毒素處理12 h后即超過對照組，在36 h達(dá)到最高。隨著水稻紋枯病菌毒素處理時(shí)間的增加，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性不斷升高，最后在60 h達(dá)到最高峰。但是水稻體內(nèi)的磷酸酯酶活性變化呈峰狀，時(shí)而增大時(shí)而減小［12］。毒素接種到水稻上72 h后，能抑制植株體內(nèi)過氧化物酶的活性，進(jìn)而阻止防御蛋白的表達(dá)［20］。

6 紋枯病菌毒素抑制物

研究表明，毒素的活性能用黃綠青霉產(chǎn)生的α-葡萄糖苷酶來抑制，滅活后的毒素能有效地減少植物組織電解質(zhì)的外漏［20］。椰子樹葉的蛋白提取物也能減少水稻紋枯病菌毒素的產(chǎn)生，處理30 min后就能觀察到植物組織電解質(zhì)的外漏有所減輕，96～120 h后能有效減輕紋枯病的發(fā)病癥狀［21］。

7 研究展望

目前對紋枯病菌毒素的研究還處于初級(jí)階段，其活性成分和致病機(jī)制尚不清楚;雖然陸續(xù)有許多真菌的抑制產(chǎn)毒基因被克隆，但在紋枯病菌上的類似研究還很少;還缺乏對紋枯病菌毒素的快速檢測技術(shù)等。開展的一些抑制紋枯病菌毒素產(chǎn)生研究還多處于實(shí)驗(yàn)室階段，其使用和防效仍有待深入研究。

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