泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的不對稱分離與T細(xì)胞命運(yùn)決定

周立強(qiáng) 沈關(guān)心 (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，武漢430030)

在干細(xì)胞的不對稱分裂中，母細(xì)胞分裂成為具有不同命運(yùn)的兩個(gè)子細(xì)胞[1]。在這個(gè)過程中，關(guān)鍵的命運(yùn)決定因子定位在分裂細(xì)胞的一極，并引起兩個(gè)子細(xì)胞獲得不同數(shù)量的關(guān)鍵決定因子。在果蠅(Drosophila)的神經(jīng)元干細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子Prospero作為終末分化和自我更新的開關(guān)[1]。

而在效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的命運(yùn)決定中，也發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[2-5]。遺傳證據(jù)提示，T 盒轉(zhuǎn)錄因子(T-box transcription factor，T-bet)，在激活的初始CD8+T細(xì)胞中是一個(gè)關(guān)鍵的命運(yùn)決定因子，能促使初始CD8+T細(xì)胞分化成為效應(yīng)T細(xì)胞，而抑制初始CD8+T細(xì)胞向記憶T細(xì)胞轉(zhuǎn)變[2]。在激活的初始CD4+T細(xì)胞中，T-bet促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)變，而抑制初始CD4+T細(xì)胞向Th2和Th12細(xì)胞群轉(zhuǎn)變[6]。這些因子在數(shù)量上的小變化將顯著影響T細(xì)胞的命運(yùn)[2-5]。上述結(jié)果提示，這些關(guān)鍵因子的不對稱分離，能決定T細(xì)胞命運(yùn)。

1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解途徑的簡介

泛素蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasomal system，UPS)由包括泛素(Ubiquitin)、泛素激活酶(Ubiquitin-activating enzymes，E1)、泛素結(jié)合酶(Ubiquitin-conjugating enzymes，E2)、泛素連接酶(Ubiquitin ligases，E3)、蛋白酶體(Proteasomes)和去泛素化酶(Deubiquitinases，Dub)在內(nèi)的至少6個(gè)組分組成。泛素是這個(gè)系統(tǒng)的中心，在E1、E2和E3的作用下能與需降解的靶蛋白相結(jié)合，并且能被Dub 從靶蛋白上解除[7]。

泛素僅僅在真核生物中被發(fā)現(xiàn)，在大部分組織中表達(dá)，且高度保守。泛素通過泛素化的方式來調(diào)節(jié)其靶蛋白，從而參與細(xì)胞的活動(dòng)過程[7]。理論上，蛋白中任何賴氨酸殘基均能被泛素鏈接，包括泛素自身。而泛素化靶蛋白生物功能的不同，取決于泛素化類型。

泛素化可分為三種類型[8]:①單泛素化(Monoubiquitination);②多次泛素化(Multiubiquitination or polymonoubiquitination):蛋白被多次單泛素化;③多泛素化(Polyubiquitination):蛋白被多泛素鏈所結(jié)合。不同的泛素化類型調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞過程，包括蛋白降解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜運(yùn)輸、DNA修復(fù)、染色體重塑(Chromatin remodeling)、過氧化物酶體的生物合成(Peroxisome biogenesis)和病毒發(fā)芽(Viral budding)。例如在泛素的第11位賴氨酸(11th lysine，K11)和第48位賴氨酸(48th lysine，K48)的多泛素化主要參與蛋白降解[8]。

泛素化過程，也稱為泛素化級聯(lián)反應(yīng)(Ubiquitination cascade)，是一個(gè)ATP依賴的酶催化反應(yīng)，需要至少三種類型的酶，包括 E1、E2和 E3[9]。泛素通過E1使用ATP作為能量的來源形成泛素-腺苷中間體(Ubiquitin-adenylate intermediate)而被激活。接著，泛素被轉(zhuǎn)移到E1活化位點(diǎn)(半胱氨酸殘基)，而引起形成泛素的羰基C-末端和E1的半胱氨酸巰基之間的硫酯鍵。隨后，激活的泛素通過反式(硫代)酯化反應(yīng)[trans(thio)esterification reaction]從E1轉(zhuǎn)移到E2的半胱氨酸活化位點(diǎn)上。最后，能識(shí)別靶蛋白的特異識(shí)別分子的E3，通過與E2和底物相互作用，使得靶蛋白的賴氨酸和泛素的甘氨酸C-末端之間形成異肽鍵(Isopeptide bond)[10]。

在人類的基因組中，有兩個(gè)基因編碼E1，60～100 個(gè)基因編碼 E2s，1000 多個(gè)基因編碼 E3s[7]。這些酶形成一個(gè)等級結(jié)構(gòu)，控制整個(gè)泛素化過程。在泛素化級聯(lián)反應(yīng)中，E1能結(jié)合幾十個(gè)E2s，E2s又能結(jié)合上百個(gè)E3s，E3s特異性結(jié)合上千個(gè)靶蛋白[10]。

蛋白酶體是一個(gè)分子量超過2000道爾頓，由一個(gè)20S的核心顆粒和兩個(gè)19S的調(diào)節(jié)顆粒組成的26S的桶狀大蛋白復(fù)合體。蛋白的K48或者K11被多泛素化后，將在桶狀蛋白內(nèi)水解[8]。

Fuentealba等[11]最近研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞分裂時(shí)，泛素化的待降解蛋白被一個(gè)子細(xì)胞所遺傳。在分裂的人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)免疫組化染色可見，在80% ～90%的有絲分裂中，不同位點(diǎn)的多泛素化的同一種蛋白是不對稱分離的，提示這種不對稱分離可能導(dǎo)致子細(xì)胞的不同命運(yùn)。Narimatsu等[12]發(fā)現(xiàn)，E3參與了細(xì)胞的不對稱分裂過程。Chang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體的不對稱分離參與了一種T細(xì)胞命運(yùn)決定因子的不對稱分離的過程，從而導(dǎo)致T細(xì)胞的不同命運(yùn)。這些結(jié)果提示，UPS可能通過引起T細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白的不對稱分離，從而引起 T細(xì)胞不對稱分裂的命運(yùn)。

2 蛋白酶體不對稱分離與T細(xì)胞命運(yùn)決定

2.1 蛋白酶體不對稱分離的發(fā)現(xiàn) 2011年，Chang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，在激活的初始T細(xì)胞進(jìn)行分裂過程中，T-bet在子細(xì)胞之間發(fā)生不對稱分離。并且，T-bet的不對稱性調(diào)節(jié)機(jī)制與有絲分裂過程中蛋白酶體依賴的降解機(jī)制的不對稱分布有關(guān)。蛋白酶體的定位與T-bet相反，以至于獲得少量蛋白酶體的子細(xì)胞獲得更多的T-bet。T-bet的不對稱性能通過抑制蛋白酶體依賴的降解而被阻止，表明T-bet和蛋白酶體的不對稱分布相關(guān)。在有絲分裂過程中，抑制蛋白酶體的不對稱分離，可阻止T-bet的不對稱分離。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體的不對稱分離，引起有絲分裂過程中決定因子的不對稱降解，使得關(guān)鍵決定因子不對稱分類進(jìn)入兩子細(xì)胞。

蛋白酶體的不對稱分離引起T-bet在母細(xì)胞分裂過程中的不對稱分離，導(dǎo)致T-bet在子細(xì)胞中的數(shù)量上的異常，從而將導(dǎo)致子細(xì)胞的不同命運(yùn)。遺傳獲得T-bet多的初始CD8+T細(xì)胞分化為效應(yīng)T細(xì)胞，而獲得T-bet少的細(xì)胞則向記憶T細(xì)胞轉(zhuǎn)變;遺傳獲得T-bet多的初始CD4+T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，而獲得T-bet少的細(xì)胞則向Th2和Th12細(xì)胞轉(zhuǎn)變。

2.2 參與蛋白酶體不對稱分離的機(jī)制 Chang等[13]的研究提示，酪氨酸激酶ITK可能是一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)。ITK參與T細(xì)胞受體結(jié)合的下游事件，并對T細(xì)胞的發(fā)展和分化途徑起作用[14]。目前的研究提示ITK的另一作用是在有絲分裂的過程中，使得T-bet被蛋白酶體依賴的降解途經(jīng)所降解。在ITK缺陷的T細(xì)胞，將使得T-bet的不對稱分離的現(xiàn)象不存在，并且不能使T-bet進(jìn)入遠(yuǎn)端的子細(xì)胞(The distal daughter cell)，干擾子細(xì)胞的能力而變成記憶細(xì)胞。這些結(jié)果提示ITK在CD8+記憶細(xì)胞發(fā)育中的起作用[15]。在CD4+T細(xì)胞也是相似的。ITK缺陷導(dǎo)致T-bet不對稱性消失，向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化減少。這與在ITK缺陷的小鼠中觀察到Th2細(xì)胞分化障礙的結(jié)果一致[16]。

3 泛素化蛋白的不對稱分離與子細(xì)胞

3.1 泛素化蛋白的不對稱分離的發(fā)現(xiàn) 自從1882年Flemming描述了有絲分裂后，對于體細(xì)胞分裂的研究集中在細(xì)胞物質(zhì)的均等分離上，特別是染色體和參與有絲分裂的細(xì)胞器[17]。而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，許多有絲分裂是不均等的，比如待蛋白酶體降解的泛素化蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)誘發(fā)的Smad1信號(hào)能被復(fù)雜的UPS降解途徑所調(diào)節(jié)[11]。Smad1在被BMP受體(BMP receptor，BMPR)進(jìn)行C-末端磷酸化而激活后，被MAPK(Mitogen-activated protein kinases)和糖原合酶激酶3(Glycogen synthase kinase 3，GSK3)在其連接區(qū)域連續(xù)磷酸化。MAPK和GSK3的磷酸化對于Smad1的多泛素化和降解是必要的[18]。Fuentealba等[11]使用針對第214位絲氨酸(Ser-214，pS-mad1MAPK)和第210位絲氨酸(Ser-210，pSmad1GSK3)的磷酸化特異性抗體(potent phospho-specific antibodies)追蹤細(xì)胞內(nèi)Smad1蛋白的定位，發(fā)現(xiàn)Smad1蛋白被特異性降解。在分裂的人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)免疫組化染色顯示，在80%～90%的有絲分裂中，pSmad1MAPK和pS-mad1GSK3是不對稱分裂的，而總的Smad1是均勻的。這種現(xiàn)象是意想不到的，因?yàn)閔ESCs的自我更新的分裂一直被認(rèn)為是對稱分裂[19]。同樣使用Cos7細(xì)胞，pSmad1MAPK、pSmad1GSK3、被 GSK3 磷酸化的 β-連環(huán)蛋白、所有多泛素化的蛋白也是不對稱分裂的。這種不對稱分布至少連續(xù)保持三代。泛素化蛋白的不對稱性也發(fā)生在體內(nèi)，因?yàn)樵谂弑P階段的果蠅(Drosophila)胚胎中，MAPK磷酸化的Mad臨近兩個(gè)中心體的一個(gè)，提示體內(nèi)的不對稱現(xiàn)象。

3.2 泛素化蛋白不對稱分離的機(jī)制 眾所周知，中心體能確保細(xì)胞進(jìn)行均等的有絲分裂，并由兩個(gè)被基質(zhì)蛋白(matrix of proteins)[例如γ-微管蛋白和中心粒周圍蛋白(Pericentrin)]所形成的微管組織中心[microtubule-organizing center(MTOC)]所包圍的小中心粒組成[17]。最近研究發(fā)現(xiàn)，中心體還在細(xì)胞中擔(dān)當(dāng)?shù)鞍姿庵行牡慕巧?，用蛋白酶體抑制劑處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞群中，未降解蛋白積累，并引起中心體周圍物質(zhì)(Peripheral centrosomal material)顯著增多[20]。蛋白酶體集中在許多細(xì)胞群的中心體[21]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，需降解的泛素化Smad1定位在Cos7細(xì)胞的中心體區(qū)域[18]。

中心粒是半保留式復(fù)制[17]，在大部分分裂間期，中心體或微管輻射的細(xì)胞中心仍優(yōu)先與母中心粒相關(guān)[22]。在干細(xì)胞分化過程中，不對稱細(xì)胞分裂已經(jīng)被證實(shí)[23]。在一些情況下，母中心體在不對稱分裂過程中與干細(xì)胞相關(guān)[11]。因此，中心體周圍物質(zhì)的不對稱遺傳影響干細(xì)胞分化的結(jié)果。

Fuentealba等人[11]推測在中心粒分裂時(shí)的中心體周圍蛋白不對稱遺傳并在G2/M轉(zhuǎn)換時(shí)遷移到細(xì)胞的另一極。在G2/M期，中心粒分離而中心體周圍物質(zhì)仍保留在一極。而這種不對稱分布是為了讓中心體周圍物質(zhì)被一個(gè)子細(xì)胞所遺傳。

3.3 泛素化蛋白不對稱分離的意義 從功能的觀點(diǎn)來看，待降解的泛素化蛋白的不對稱分裂使得只有一個(gè)子代細(xì)胞被遺傳這些蛋白，而這對于那些難降解蛋白是非常有意義的，并與帕金森病、阿爾海默病和亨廷頓病相關(guān)[24]。有可能，積累太多的難降解蛋白的增殖細(xì)胞會(huì)凋亡。因此，分裂的細(xì)胞群進(jìn)行這種生理機(jī)制在細(xì)胞分裂時(shí)清除自身需降解的蛋白。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，損傷的羰基化蛋白質(zhì)選擇性的保留在母細(xì)胞中而沒有被出芽所遺傳，而這可能是維持新生細(xì)胞健康的機(jī)制[25]。相似的，擁有蛋白質(zhì)折疊疾病(Protein folding disease)神經(jīng)退行性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型(Neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 3)的腸隱窩(Intestinal crypts)患者在分化的隱窩細(xì)胞而不是干細(xì)胞中積累聚集體[24]。

而海洋蝸牛Ilyanassa obsoleta特異性mRNA(編碼調(diào)節(jié)蛋白，例如Tolloid和Dpp)的降解與一個(gè)子中心體相關(guān)，這證實(shí)了不對稱細(xì)胞命運(yùn)決定的機(jī)制[26]。在線蟲和環(huán)節(jié)動(dòng)物胚胎的降解過程中，這種細(xì)胞機(jī)制也參與了核β-連環(huán)蛋白的不對稱分離[27]，提示這種蛋白降解機(jī)制可能參與細(xì)胞的不對稱的命運(yùn)，并可能參與T細(xì)胞不對稱分裂的過程。

4 泛素連接酶不對稱分離與子細(xì)胞

4.1 泛素連接酶不對稱分離的發(fā)現(xiàn) 平面細(xì)胞極性(Planar cell polarity，PCP)的研究發(fā)現(xiàn)一組核心進(jìn)化上保守的蛋白[包括 Van Gogh/Strabismus(Vang/Stbm or Vangl)，F(xiàn)lamingo/Starry night/Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor(Fmi/Stan/Celsr)，F(xiàn)rizzled(Fz/Fzd)，Dishevelled(Dsh/Dvl)，Prickle(Pk)，Diego/Diversin]在其中起重要作用[28]。并且在大鼠的耳蝸毛細(xì)胞中，Celsr1，Vangl2，Dvl1/2和 Fz3/6的突變能破壞靜纖毛的方向[29]。重要的是，這些突變展示了嚴(yán)重的神經(jīng)管缺陷和縮短的前后側(cè)(Anterior-posterior，AP)軸，伴隨著擴(kuò)張的內(nèi)外側(cè)軸[29]。許多研究發(fā)現(xiàn) PCP蛋白(例如 Dvl、Pk、Vangl和 Diego)是不對稱分布的[30]。在果蠅的翅膀中，無論是近端的(Proximal)Vang和Pk，還是遠(yuǎn)端位于細(xì)胞表面的Fz、Dvl和Diego，這些PCP組分形成離散的蛋白復(fù)合體。這種PCP蛋白不對稱分布的機(jī)制仍不清楚。

Smad泛素化調(diào)節(jié)因子-1(Smad ubiquitination regulatory factor-1，Smurf1)和 Smurf2與 C2-WWHECT類的E3泛素連接蛋白相關(guān)，而C2-WW-HECT類的E3泛素連接蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)，細(xì)胞極性和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性中起重要作用[31]。特別是Smurf是極性蛋白Par6的效應(yīng)因子，通過使RhoA降解調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和極性[32]，并且在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)]過程中，Smurf向Par6以TGFβ依賴的方式招募，來使緊密連接解離[33]。Narimatsu 等[12]發(fā)現(xiàn)在大鼠 Smurf1和Smurf2的突變將導(dǎo)致PCP的收斂和伸展運(yùn)動(dòng)(Convergence and extension movements，CE)消失，并且Par6-Dvl-Smurf復(fù)合體在細(xì)胞中是不對稱分布的，并與Dvl、Vangl和Pk分布相反。這些研究結(jié)果提示，Smurf泛素連接酶在非經(jīng)典的Wnt途徑中起作用，通過調(diào)節(jié)核心PCP信號(hào)途徑的組分，引起這些關(guān)鍵的細(xì)胞極性因子的不對稱分布。

4.2 泛素連接酶不對稱分離的機(jī)制 蔬菜中的PCP被非經(jīng)典的Wnt信號(hào)和一系列核心的PCP途徑組分所調(diào)節(jié)。Narimatsu等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，Smurf在哺乳動(dòng)物中是PCP信號(hào)的一個(gè)組分，證明Smurf通過Dvl被招募到Par6的非經(jīng)典的Wnt信號(hào)途徑調(diào)節(jié)PCP途徑的組分的降解，控制PCP途徑的組分Pk1的不對稱分布。這種被Smurf泛素連接酶調(diào)節(jié)的PCP組分的不對稱分布，在調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞極性上，起重要作用。并且這種機(jī)制的存在提示，泛素連接酶的不對稱分布可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子引起細(xì)胞分裂后的子細(xì)胞命運(yùn)決定中起重要作用。這種可能同樣會(huì)發(fā)生在T細(xì)胞中。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，UPS系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白因子的不對稱分布中起關(guān)鍵作用，并且提示其對細(xì)胞不對稱分裂后細(xì)胞命運(yùn)決定的作用。蛋白酶體的不對稱分布通過影響T細(xì)胞命運(yùn)關(guān)鍵決定因子的不對稱分布，而決定T細(xì)胞的命運(yùn)。提示UPS系統(tǒng)可能參與T細(xì)胞的命運(yùn)過程。而泛素化蛋白的不對稱分布對細(xì)胞命運(yùn)的影響，泛素連接酶對細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵因子的不對稱分布的影響，都從不同角度提示了UPS對細(xì)胞不對稱分裂的影響。UPS的不同機(jī)制可能參與決定T細(xì)胞不同命運(yùn)。隨著UPS對T細(xì)胞命運(yùn)決定的影響的研究，將有助于更深入對T細(xì)胞分化的理解，對整個(gè)免疫反應(yīng)的理解，從而對臨床上許多免疫相關(guān)疾病的治療提供新的策略。

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