白念珠菌肺部感染動(dòng)物模型

許 群 眭 建 (江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

侵襲性真菌感染近年有明顯的上升趨勢，其主要原因是臨床上長期使用廣譜抗生素、免疫抑制劑，放化療的綜合應(yīng)用及艾滋病的流行，致使人體的正常菌群失調(diào)，機(jī)體免疫功能減低，外源性真菌乘虛侵入或內(nèi)源性真菌在體內(nèi)生長繁殖而引發(fā)感染〔1〕。國內(nèi)外報(bào)道引起感染的真菌種類主要有念珠菌、曲霉菌、隱球菌、毛霉菌等，其中白念珠菌的感染最多見〔2，3〕。白念珠菌致病具有多變性，包括念珠菌血癥、外陰陰道念珠菌病(VVC)〔4〕、皮膚黏膜念珠菌病、臟器感染等，其中呼吸道感染發(fā)病率最高〔2〕。侵襲性肺部真菌感染的臨床及影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性，難以獲得組織和病原學(xué)的證實(shí)，病情易被原發(fā)病或其他并發(fā)癥掩蓋，造成誤診、漏診，從而延誤治療;未及時(shí)處理的肺部真菌感染患者的病死率可達(dá)30% ～80%〔5〕。因此，建立相應(yīng)的真菌模型用于研究相關(guān)指標(biāo)，指導(dǎo)臨床實(shí)踐，能為改善真菌感染現(xiàn)狀提供可能。

1 模型的建立

目前用于白念珠菌模型研究的動(dòng)物主要有小鼠、大鼠、豚鼠、兔及基因敲除鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物白念珠菌感染途徑主要有經(jīng)口腔灌喂、呼吸道、陰道、腹腔及靜脈系統(tǒng)途徑接種。肺部真菌感染的模型，大多數(shù)通過呼吸道建立，如氣管切開接種法和滴鼻法，也有采用靜脈接種建立系統(tǒng)性感染模型。有研究者采用密閉空間分生孢子吸入感染的方法，成功建立了免疫抑制小鼠的肺部曲霉菌感染模型〔6〕。其中，經(jīng)氣管切開接種法建立的模型雖成功率較高，但是操作繁瑣且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷害嚴(yán)重，對動(dòng)物耐受性要求高。

2 白念珠菌致病機(jī)制

2.1 宿主因素 真菌極少引起健康和具有免疫能力的個(gè)體的疾病，即使不斷暴露于具有傳染力的繁殖體。宿主主要通過多種不同的保護(hù)機(jī)制來阻止真菌入侵，皮膚黏膜的完整性，機(jī)體自身產(chǎn)生的長鏈不飽和脂肪酸，標(biāo)準(zhǔn)菌落的pH競爭，上皮更新及角質(zhì)層的自然干燥阻止了真菌的生長。其他組織像毛細(xì)支氣管，胃腸道和陰道穹窿則通過體液中的黏膜上皮細(xì)胞含有的抗菌物質(zhì)或通過纖毛清除異物起作用。

白念珠菌是引起侵襲性真菌感染最主要的病原菌。新生兒在分娩過程中通過陰道腔時(shí)最先接觸白念珠菌，在此過程中念珠菌便寄生在新生兒的口腔前庭和部分胃腸道內(nèi)，并終生攜帶，但是在正常機(jī)體內(nèi)一般不致病。當(dāng)白念珠菌在偶然穿過宿主的皮膚和黏膜屏障且感染的數(shù)量及毒力到達(dá)一定程度，或者宿主免疫缺陷時(shí)，才會(huì)引起機(jī)體感染。細(xì)胞免疫缺陷的病人皮膚黏膜易感染，但并不發(fā)展成念珠菌血癥，相反全身性的感染更易發(fā)生在嗜中性白細(xì)胞減少癥或嗜中性粒細(xì)胞失調(diào)的病人〔7〕。局限于肺部的白念珠菌病少見，常見的是念珠菌血癥引起的多臟器念珠菌病，并包括肺部。

2.2 菌體因素 有研究表明〔8〕，白念珠菌致病主要與黏附能力、受體形態(tài)轉(zhuǎn)化、胞外酶等有關(guān)，其分泌的毒素和水解酶，有破壞組織的能力。念珠菌黏附到宿主細(xì)胞表面是致病的首要條件，菌體可廣泛黏附于上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等通過多種途徑引起局部或播散性感染〔9〕。白念珠菌可存在于多種形態(tài)，包括菌絲、假菌絲和酵母形式，從酵母到絲狀形態(tài)過渡的能力與毒力相關(guān)〔10〕。細(xì)胞外水解酶中，分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)是潛在的毒力因素，已知SAP能降解細(xì)胞外基質(zhì)、角蛋白及免疫球蛋白等，為白念珠菌提供營養(yǎng)，并促進(jìn)白念珠菌黏附上皮細(xì)胞，侵入宿主造成組織損傷及協(xié)助其逃逸宿主防御機(jī)制〔11〕。另外〔12〕，念珠菌菌體成分可激活補(bǔ)體旁路途徑，產(chǎn)生補(bǔ)體趨化因子和過敏毒素，導(dǎo)致局部水腫和炎細(xì)胞浸潤。真菌腺嘌呤環(huán)化酶Cyr1p是cAMP/PKA信號傳導(dǎo)通路的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，該通路控制著不同的相關(guān)感染性狀，包括菌絲的形態(tài)形成。然而，目前有關(guān)血清菌絲誘導(dǎo)特點(diǎn)及其真菌傳感器的機(jī)制仍屬未知。Xu等〔13〕的分析結(jié)果表明，活化血清的組分中含有細(xì)菌的類肽聚糖(PGN)分子，而有幾個(gè)純化和合成的胞壁酰二肽(MDPs)與細(xì)菌的類肽聚糖的亞基能夠有效地促進(jìn)白念珠菌的菌絲生長。通常情況下，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白Nod1和Nod2可以通過富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)域識(shí)別 PGN的類似物，研究者發(fā)現(xiàn)，胞壁酰二肽(MDPs)可以通過直接與其LRR域結(jié)合來激活Cyr1p。另有研究發(fā)現(xiàn)亦可直接激活Cyr1p催化結(jié)構(gòu)域〔14〕。

3 白念珠菌肺部感染動(dòng)物模型的應(yīng)用

3.1 免疫學(xué)研究 在機(jī)體抗真菌感染中，病原識(shí)別受體(PRR)對其進(jìn)行識(shí)別并啟動(dòng)固有免疫，Toll樣受體(TLRs)是最重要的PRR之一。真菌侵入機(jī)體后，主要由TLR2和TLR4等通過識(shí)別不同的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，啟動(dòng)固有細(xì)胞免疫，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞被激活并釋放細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)。TLR4主要識(shí)別白念珠菌壁上的甘露聚糖啟動(dòng)信號傳導(dǎo)，而TLR2則主要識(shí)別β-葡聚糖介導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌〔15〕。有研究發(fā)現(xiàn)〔16〕感染白念珠菌的TLR4缺陷小鼠，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出較低的吞噬作用并且趨化因子CXCL1、白介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平較低，表明TLR4對巨噬細(xì)胞識(shí)別白念珠菌的感染至關(guān)重要。

宿主巨噬細(xì)胞通過呼吸爆發(fā)和釋放細(xì)胞因子吞噬并殺滅入侵的白念珠菌，而抗原遞呈細(xì)胞(APCs)對念珠菌抗原進(jìn)行加工并遷移至淋巴結(jié)，在MHC-Ⅱ類分子的作用下向CD4+T亞群細(xì)胞分化，進(jìn)而進(jìn)一步分化為TH 1和TH 17型細(xì)胞〔7〕。白介素-17(IL-7)是TH 17細(xì)胞產(chǎn)生的最主要的細(xì)胞因子，研究發(fā)現(xiàn)人外周血中分泌的IL-17為CCR6+CD4記憶性T細(xì)胞，通過對其細(xì)胞抗原特異性的分析，TH 17細(xì)胞可能在真菌感染中發(fā)揮重要作用〔17〕。IL-17可以產(chǎn)生類似于 IL-1β、TNF-α或脂多糖(LPS)的作用，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，IL-17A敲除的小鼠，其嗜中性粒細(xì)胞到達(dá)感染組織的數(shù)量減少〔18〕。在大鼠支氣管肺白念珠菌感染模型的研究中，發(fā)現(xiàn)IL-17的水平與機(jī)體炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)，可能通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞在氣道的聚集參與炎癥反應(yīng)〔19〕。TH 1細(xì)胞分泌的 γ-干擾素(IFN-γ)與白介素-12(IL-12)，可激活巨噬細(xì)胞并加強(qiáng)機(jī)體對再感染念珠菌的抵抗力。另外，CD4+th1還可誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，控制真菌感染的擴(kuò)散。傅穎媛等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，在Balb/c小鼠白念珠菌感染早期多以TH 1型細(xì)胞應(yīng)答為主，后期TH 1/TH 2型細(xì)胞因子均升高，示體液免疫也參與了機(jī)體抗感染。

3.2 指導(dǎo)臨床診斷 Mitra等〔10〕報(bào)道了一種新的進(jìn)行性白念珠菌系統(tǒng)性感染的成像模型，試驗(yàn)者在小鼠體內(nèi)接種標(biāo)記了綠色熒光蛋白(GFP)的白念珠菌，能在共焦顯微鏡下顯示體內(nèi)形成的系統(tǒng)性感染狀態(tài)，進(jìn)而觀察到絲狀體的生長及微膿瘍在小鼠體內(nèi)的形成。謝麗璇等〔21〕發(fā)現(xiàn)在免疫抑制的新西蘭兔肺白念珠菌病模型中，胸部CT表現(xiàn)多樣，其中實(shí)變最多見，其次為磨玻璃、結(jié)節(jié)影，各種征象可單獨(dú)發(fā)生，亦可組合發(fā)生，為臨床影像學(xué)診斷肺部白念珠菌感染提供了參考。

3.3 疫苗研制 目前認(rèn)為治療白念珠菌除了抗真菌藥物外，還需使機(jī)體處于高免疫狀態(tài)，有效的疫苗可以大大降低真菌感染率和死亡率。疫苗要應(yīng)用于臨床，必須首先在動(dòng)物模型上進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)其有效性。近年來研究的白念珠菌疫苗主要有:菌體滅活疫苗，但效果并不十分有效;DNA疫苗，其免疫原性并不清楚，主要還處于動(dòng)物研究階段;亞單位疫苗，即將念珠菌中的特異性抗原進(jìn)行提純，制成疫苗。另外還有P43疫苗、殺傷細(xì)胞毒素疫苗及以DC為基礎(chǔ)的“佐劑”型疫苗等，但對于疫苗的作用機(jī)制和人體安全性仍然需要進(jìn)一步研究〔22，23〕。李麗波等〔24〕在進(jìn)行系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠研究中，發(fā)現(xiàn)卡介苗提前免疫組的存活期時(shí)間及腎組織菌落計(jì)數(shù)較生理鹽水對照組有明顯改善。

3.4 抗真菌藥物實(shí)驗(yàn) 目前較有效的抗真菌藥物有氟康唑、兩性霉素B脂質(zhì)體、伊曲康唑、卡泊芬凈及米卡芬凈等，臨床上大多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)用藥。但由于現(xiàn)有藥物的不良反應(yīng)、大量耐藥白念珠菌菌株和新菌株的出現(xiàn)以及復(fù)發(fā)率的上升，使得研究和開發(fā)新型藥物不容松懈。細(xì)胞因子作為一種抗真菌感染的輔助治療因子，已經(jīng)受到越來越多研究者的關(guān)注。IFN-γ、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-12及TNF-α在動(dòng)物感染模型中有較好的抗菌作用。特別是抗真菌藥與細(xì)胞免疫因子聯(lián)合應(yīng)用時(shí)不僅能提高療效，而且還能降低耐藥性和潛在毒性〔25〕。最近，Tsai等〔26〕研究發(fā)現(xiàn)白介素-37(IL-37)能通過優(yōu)先結(jié)合白念珠菌細(xì)胞壁上的主要成分甘露聚糖來發(fā)揮對菌體黏附和聚集的抑制作用，為防治白念珠菌感染提供了一種新的策略。在抗白念珠菌感染的研究中，越來越多的中藥被發(fā)現(xiàn)有較好的抗真菌作用，有試驗(yàn)者〔27〕發(fā)現(xiàn)大蒜素注射液能提高正常感染及免疫抑制感染狀態(tài)下小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖活性和IFN-γ水平。另在參芪扶正液輔助治療肺白念珠菌感染的實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)其與抗真菌藥伍用可提高感染小鼠的生存率，增強(qiáng)抗真菌藥物的療效〔28〕。

4 討論

在白念珠菌感染的研究中，動(dòng)物模型廣泛被應(yīng)用，并也取得了一定的成果，但多是研究真菌的致病機(jī)制及抗真菌藥物的研發(fā)。而臨床上侵襲性肺部真菌感染沒有特征性，易被原發(fā)病或繼發(fā)細(xì)菌、病毒感染的表現(xiàn)掩蓋，且與其他肺部感染疾病的鑒別診斷不明確，早期診斷十分困難。傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)陽性率較低且耗時(shí)長，即使陽性有時(shí)也難以確定是定植、污染或感染;病理學(xué)檢查結(jié)果雖可靠，但屬于有創(chuàng)檢查，患者較難接受。一些新興的血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法雖可用于早期診斷，但是敏感性和特異性的結(jié)果并不理想。肺部真菌感染的病人經(jīng)確診時(shí)往往感染較嚴(yán)重，加之本身機(jī)體狀態(tài)比較差，故感染較難控制。發(fā)病率和死亡率居高不下的現(xiàn)狀迫切需要新的診斷方法來獲取更多的信息，譬如借助動(dòng)物模型進(jìn)行疾病的發(fā)展過程和影像學(xué)等方面的研究，進(jìn)一步完善各項(xiàng)指標(biāo)，建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的診斷和治療方案。

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