銀屑病皮損組織端粒DNA長(zhǎng)度的定量研究

王大虎 馬喜興 李艷玲 馬耀輝 李玉平 四榮聯(lián)

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，河北 石家莊 050000)

端粒(telomere)是位于真核細(xì)胞線(xiàn)性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由簡(jiǎn)單的DNA串連重復(fù)序列和一系列相關(guān)的蛋白質(zhì)組成。端粒作為分子鐘控制著人類(lèi)細(xì)胞的復(fù)制與衰老，隨著正常體細(xì)胞細(xì)胞增殖，端粒酶(telomerase)活性缺如，導(dǎo)致DNA合成的后隨鏈不能有效的復(fù)制出染色體3'末端，其端區(qū)長(zhǎng)度逐漸縮短。當(dāng)其長(zhǎng)度減小到一定的臨界值時(shí)就失去了保護(hù)染色體末端的功能，細(xì)胞即趨向于衰老、死亡〔1〕。正常細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)不到端粒酶活性，只有在某些特殊細(xì)胞中才能檢測(cè)到，包括造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、皮膚細(xì)胞以及生殖細(xì)胞等具有增殖潛能的細(xì)胞〔2〕。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，盡管端粒酶活性主要在大多數(shù)腫瘤中表達(dá)，但在某些非惡性皮膚病如銀屑病皮損和常青藤誘發(fā)的皮炎中也有表達(dá)的跡象〔3〕。本研究測(cè)定銀屑病皮損中端粒DNA長(zhǎng)度的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 所有標(biāo)本均來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科門(mén)診和住院手術(shù)取病理活檢患者30例，經(jīng)臨床及病理確診為尋常型銀屑病患者，分別取病損和病損旁皮膚。其中斑塊狀23例，點(diǎn)滴狀7例。對(duì)照組為來(lái)自外科整形術(shù)的非暴露部位正常皮膚30例?；颊咂p經(jīng)手術(shù)切取后，一部分送常規(guī)組織學(xué)檢查，另一部分立刻固定于70%乙醇溶液用于流式胞術(shù)檢測(cè)。

1.2 主要試劑 端粒肽核酸(PNA)探針試劑盒系DAKO公司產(chǎn)品。

1.3 原位雜交 實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備后，取2×106個(gè)細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組和背景對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組加入300 μl含 FITC-(CCCTAA)3PNA探針雜交液，對(duì)照組加300 μl空白雜交液，混勻，87℃避光孵育15 min變性;室溫避光過(guò)夜雜交;加入1 ml洗液(1∶10 稀釋)，混勻4℃孵育10 min，1 500 r/min 離心3 min，棄上清，重復(fù)1次;DNA染色加，入0.5 ml PI染液(1∶10稀釋)，混勻，4℃避光孵育2 h，400目銅網(wǎng)過(guò)濾后進(jìn)，行流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法 采用美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics2XLⅡ型流式細(xì)胞儀，激發(fā)光源為15 mW氬離子激光器，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm。檢測(cè)前以flow-check TM Fluorpheres(10 μm)熒光微球(REF6605359，Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA 92835)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器 CV值在 2%以?xún)?nèi)。

FL1通道檢測(cè)FITC熒光強(qiáng)度，F(xiàn)L3通道檢測(cè)PI熒光強(qiáng)度，端粒熒光定量即Q-FISH值由減去背景后的G0/G1期二倍體細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度所決定。Q-FISH值=實(shí)驗(yàn)樣品平均熒光強(qiáng)度-背景對(duì)照平均熒光強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 端粒DNA長(zhǎng)度在銀屑病皮損中的表達(dá) FCM檢測(cè)的QFISH值分別為28.87±6.57、35.89±8.13和52.46±7.95，銀屑病皮損組端粒長(zhǎng)度明顯短于正常皮膚組(P＜0.01)，銀屑病皮損旁皮膚組端粒長(zhǎng)度明顯短于正常皮膚組(P＜0.01)。

2.2 端粒DNA長(zhǎng)度變化與病變程度相關(guān)性分析 Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，端粒長(zhǎng)度與病變程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.76，P＜0.01)。按照Q-FISH值小于正常組端粒長(zhǎng)度80%(＜0.76)為縮短，大于正常組織120%(＞1.14)為延長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)劃分，從銀屑病皮損旁皮膚組到銀屑病皮損組端?？s短的陽(yáng)性率分別為40.00%(12/30)和73.33%(22/30)，呈上升趨勢(shì)(P＞0.05)。

3 討論

銀屑病(Psoriasis)俗稱(chēng)牛皮癬，好發(fā)于頭皮、四肢伸側(cè)及背部。以紅斑鱗屑為基本表現(xiàn)，病理表現(xiàn)為表皮細(xì)胞的過(guò)度增殖和分化。是一種臨床常見(jiàn)的炎癥性、難治性皮膚病，發(fā)病率約2% ～3%。在細(xì)胞的過(guò)度增殖和分化這一特點(diǎn)上，銀屑病和腫瘤，尤其是惡性腫瘤，有類(lèi)似和相近的特征。研究表明，正常細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴(lài)于細(xì)胞周期中各種調(diào)節(jié)因子的調(diào)控，任何一種調(diào)控因子發(fā)生紊亂都將導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常，誘發(fā)銀屑病、腫瘤〔4〕。臨床上可以見(jiàn)到由初發(fā)的銀屑病轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤，但是其具體發(fā)病機(jī)制如何，相關(guān)文獻(xiàn)中并沒(méi)有太多的闡述。

大量研究證實(shí)人體大多數(shù)癌和其他惡性腫瘤中均能檢測(cè)到端粒酶活性，而良性腫瘤和正常組織體細(xì)胞(非生殖細(xì)胞)缺乏或存在微弱的端粒酶活性。由于端粒酶活性也可以在炎癥性皮損中檢測(cè)到，這說(shuō)明端粒酶活性并不總是與惡性表型有關(guān)。這方面的研究涉及最多的疾病是異位性皮炎(AD)和銀屑病，盡管在非惡性病變中的端粒酶活性較惡性病變者低得多〔5〕。在非惡性皮膚病皮損中測(cè)得端粒酶活性，提示非惡性的上皮細(xì)胞亦可有一定的端粒酶活性的激活，并推測(cè)與引起病理改變的表皮增生有密切關(guān)聯(lián)。但其機(jī)制還不清楚，即在此種情形下端粒酶的表達(dá)又是通過(guò)何種途徑而激活還不得而知。

正常細(xì)胞在致癌因素作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒约?xì)胞并不意味著一定能形成腫瘤，哺乳動(dòng)物體內(nèi)有一套精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制控制著細(xì)胞的分裂次數(shù)，使細(xì)胞分裂達(dá)到一定程度后死亡。在一些腫瘤中已觀察到，染色體末端的端端融合在腫瘤形成相關(guān)基因的不穩(wěn)定性中起著重要作用，而這種融合可能起因于染色體末端長(zhǎng)片段的丟失，如端粒的丟失〔6〕?；谶@種觀點(diǎn)，筆者推斷端粒的縮短可能引起DNA的不穩(wěn)定，激活端粒酶活性而合成端粒DNA加到染色體末端，從而抵消了細(xì)胞分裂導(dǎo)致的端粒DNA消耗，并在銀屑病等疾病的形成中起著重要作用。

本研究初步證實(shí)，在銀屑病皮損中存在著端粒長(zhǎng)度的改變，其表達(dá)的強(qiáng)弱與病變進(jìn)展程度有關(guān)，提示端粒長(zhǎng)度的改變參與了銀屑病的發(fā)生。

1 Shay JW，Zou Y，Hiyama E.Telomerase and cancer〔J〕.Human Mollar Gene，2001;10:677-85.

2 Cong YS，Shay JW.Actions of human telomerase beyond telomeres〔J〕.Cell Res，2008;18(8):725-37.

3 Baerlocher GM，Mak J，Tient，et al.Telomere length measurement by fluorescence insitu hybridization and flow cytometry:tips and pitfalls〔J〕.Cytometry，2002;47(2):89-99.

4 Jurisic D，Kirin I，Rabic D，et al.The role of telomerase activity in psoriatic skin lesions〔J〕.Med Hypotheses，2007;68(5):1093-5.

5 Queiro R，Alperi M，Alonso-Castro S，et al.Patients with psoriatic arthritis may show differences in their clinical and genetic profiles depending on their age at psoriasis onse〔tJ〕.Clin Exp Rheumatol，2012;30(4):476-80.

6 Tamayo M，Mosquera A，Rego JI，et al.Differing patterns of peripheral blood leukocyte telomere length in rheumatologic diseases〔J〕.Mutat Res，2010;683(1-2):68-73.