禽流感的鑒別診斷及血清學(xué)檢測(cè)

楊明超 楊利琴 黃 猛

（1.云南省盈江縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南盈江 67900；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201；3.云南省盈江縣那邦畜牧獸醫(yī)站，云南盈江 67900）

禽流感（avian influenza，AI）是由正黏病毒科A型流感病毒屬的禽流感病毒（AIV）引起的一種家禽和野禽的感染或疾病綜合征，雞、火雞、鴨、鵝和鵪鶉等家禽、野鳥(niǎo)、水禽和海鳥(niǎo)等均可感染。這種高度接觸性的傳染病可呈無(wú)癥狀感染、不同程度的呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋率下降，以至引起頭冠和肉髯紫黑色、呼吸困難、下痢、腺胃乳頭和肌胃角膜下等器官組織廣泛性出血、胰臟壞死、纖維素性腹膜炎甚至100%致死率的急性敗血癥[1]。野鳥(niǎo)或者侯鳥(niǎo)是AIV的自然宿主，現(xiàn)已證實(shí)禽流感病毒可以由家禽直接感染人，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。根據(jù)血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）抗原性的不同，可將禽流感病毒分為16個(gè)HA亞型[2]和9個(gè)NA亞型。其中H5亞型和H7亞型為高致病性禽流感（highly pathogenic Avian influenza，HPAI），傳播迅速，病程短，可引起家禽大批死亡，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[3-4]。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，HPAIV還可以突破種間障礙，感染人并造成發(fā)病和死亡[5]。因此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office international des epizootics，OIE）將HPAI列入必須向通報(bào)的OIE疾病名錄，我國(guó)也將其定為一類動(dòng)物傳染病[6]。

在禽流感的防治過(guò)程中，快速診斷技術(shù)非常重要，傳統(tǒng)的雞胚分離、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等檢測(cè)禽流感的方法，因敏感性不高或檢驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，不能滿足現(xiàn)實(shí)檢疫和疫病防制的需要。為了更好地防制禽流感，科學(xué)工作者一直在尋求建立一種特異、快速的診斷方法，分子技術(shù)診斷方法具有高度特異性、高度敏感性、快速省時(shí)、對(duì)樣品的要求不高等優(yōu)點(diǎn)。禽流感病毒的基因組含有8個(gè)RNA片段，其中，NP蛋白的基因是禽流感的型決定基因，HA、NA蛋白的基因是亞型決定基因，現(xiàn)有分子技術(shù)診斷方法，主要針對(duì)NP、HA、NA基因的核苷酸序列建立快速診斷方法。

1 病毒的分離培養(yǎng)

病毒的分離培養(yǎng)是檢測(cè)禽組織中AIV的一種經(jīng)典、準(zhǔn)確、敏感的病原學(xué)診斷方法。目前常用的方法有雞胚分離培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)，可以作為AIV檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。但該方法的檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作程序繁雜，不適用于該病的快速診斷。

2 血清學(xué)檢測(cè)

利用抗原與抗體在體外和體內(nèi)均能發(fā)生特異性結(jié)合的特性設(shè)計(jì)的檢測(cè)抗原或抗體的一系列檢測(cè)技術(shù)，均稱為免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。由于在體外進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，一般用含有抗體的血清進(jìn)行，所以又稱為血清學(xué)技術(shù)，常用的AIV血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)有以下幾種[7]。

2.1 血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)

AIV囊膜表面的血凝素能凝集多種動(dòng)物的紅細(xì)胞，這種凝集特性能被特異的血清抑制。血凝（HA）試驗(yàn)主要用于AIV的常規(guī)檢測(cè)，血凝抑制（HI）試驗(yàn)可用于AIV的鑒定和血清中AIV抗體濃度的測(cè)定[8]。HI試驗(yàn)具有較高的特異性和敏感性，但在做HI試驗(yàn)時(shí)，需要先去除血清中的非特異性的凝集因素，同時(shí)，需要對(duì)抗原進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。目前，WHO一般采用此方法進(jìn)行全球流感病毒的監(jiān)測(cè)。

2.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂擴(kuò)散（AGP）試驗(yàn)一般用來(lái)檢測(cè)AIV的共同抗原核蛋白或基質(zhì)蛋白[9]，哈爾濱獸醫(yī)研究所禽流感研究中心研制的常規(guī)瓊擴(kuò)抗原和重組抗原已廣泛應(yīng)用于30多個(gè)省市自治區(qū)的雞群AIV疫情監(jiān)測(cè)中，效果良好[10]。

2.3 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)（IFA）是將抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。此技術(shù)最早用于鑒定和定位流感病毒感染細(xì)胞中的特異性抗原，主要是NP或MP抗原。檢測(cè)NP抗原主要出現(xiàn)核內(nèi)熒光，檢測(cè)MP抗原主要出現(xiàn)胞漿熒光，核內(nèi)也有部分熒光[9]。該技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便、敏感等特點(diǎn)，而且成本低，在流感暴發(fā)期間，比病毒分離鑒定更適合于快速診斷AI。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法具有較高的敏感性和特異性，既可以檢測(cè)抗體，又可以檢測(cè)抗原，尤其適用于大批樣品的血清學(xué)檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外大多采用間接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)雞群抗體水平【7】。李海燕等利用混和纖維素酯微孔濾膜建立了斑點(diǎn)ELISA，該方法不僅敏感性和特異性好，而且結(jié)果易于判定，非常適合現(xiàn)場(chǎng)AIV抗體的檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。

抗原的純度直接影響到ELISA方法的敏感性和特異性，王傳彬等[17]對(duì)構(gòu)建的3株H5亞型的HA單抗進(jìn)行親和層析純化，用長(zhǎng)臂活化生物素進(jìn)行標(biāo)記，建立了檢測(cè)H5亞型AIV的單抗介導(dǎo)、生物素放大的捕獲ELISA。該檢測(cè)體系的靈敏度高，能檢出0.25個(gè)血凝單位的H5亞型血凝素抗原。

最近隨著生物傳感器的快速發(fā)展，國(guó)內(nèi)出現(xiàn)了用于AIV快速檢測(cè)的蛋白芯片的報(bào)道。

2.5 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)

神經(jīng)氨酸酶抑制試（ NIT）根據(jù)A型流感病毒的表面抗原特性，特別是血HA和神經(jīng)氨酸酶（NA）特性，可通過(guò)NIT試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。NIT試驗(yàn)的一種改進(jìn)法——平板微量NIT試驗(yàn)，雖不能提供常量法的定量，但卻是A型流感病毒的病毒分類和抗體檢測(cè)的快捷方法。該方法不僅降低了抗原用量，而且可對(duì)多種分離物同時(shí)進(jìn)行抗原分類。試驗(yàn)證明，微量NIT試驗(yàn)?zāi)軐?duì)分離物做出準(zhǔn)確鑒定，而常量NIT試驗(yàn)檢測(cè)亞型混合物更敏感。

2.6 病毒中和試驗(yàn)

禽流感病毒中和試驗(yàn)（VN）的操作與其他病毒（如NDV）的中和試驗(yàn)相似。Thomas R等[7]報(bào)道，他們建立的用于AIV H5N1檢測(cè)的微量中和試驗(yàn)的敏感性要高于HI試驗(yàn)，如同時(shí)結(jié)合運(yùn)用H5型特異的Western blotting試驗(yàn)，其敏感性可達(dá)80%，特異性可達(dá)96%。

3 回顧與展望

隨著分子技術(shù)的發(fā)展，分子生物技術(shù)已被大量應(yīng)用于禽流感的快速診斷，但現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法的敏感性方面仍不及傳統(tǒng)的雞胚分離法。一直被看好的RT-PCR-ELISA的敏感性方面已超過(guò)了雞胚分離法，但需進(jìn)行PCR和ELISA2種方法的檢測(cè)，其操作較繁瑣，用于禽流感診斷需7 h以上，且用ELISA對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需打開(kāi)PCR反應(yīng)管，與普通電泳檢測(cè)一樣，實(shí)驗(yàn)室經(jīng)長(zhǎng)期檢測(cè)后，因擴(kuò)增產(chǎn)物的污染而導(dǎo)致的假陽(yáng)性將難以克服，要普及用于禽流感的快速診斷尚需進(jìn)一步的優(yōu)化與完善。熒光PCR方法雖然敏感性方面較雞胚分離法低，但操作簡(jiǎn)便（經(jīng)RNA抽提后，加樣上機(jī)即可自動(dòng)出結(jié)果），熒光檢測(cè)過(guò)程中無(wú)需打開(kāi)PCR反應(yīng)管，較好的解決了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問(wèn)題，已能完全滿足臨床樣品的檢測(cè)需要。NASBA方法的敏感性接近了雞胚分離法，因擴(kuò)增產(chǎn)物是RNA，容易被降解，而克服了污染問(wèn)題，也已滿足臨床樣品的檢測(cè)需要，所以熒光PCR和NASBA方法將在禽流感快速診斷方面起重要的作用。

[1]李海燕，辛?xí)怨?，田?guó)斌，等.間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)禽流感抗體的最佳條件[J].中國(guó)畜禽傳染病，1998，（4）：233～235.

[2]李海燕，辛?xí)怨猓飮?guó)斌，等.禽流感班點(diǎn)-ELISA診斷技術(shù)的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，21（5）：321～324.