胰島β細(xì)胞發(fā)育與再生的研究進(jìn)展*

蔣旭超，　謝志芳，　章衛(wèi)平△

(第二軍醫(yī)大學(xué) 1病理生理學(xué)教研室， 2肥胖與糖尿病研究中心，上海 200433)

糖尿病是當(dāng)今嚴(yán)重危害人類健康和社會發(fā)展的重大疾病之一，在全球不同國家和地區(qū)的發(fā)病率均呈現(xiàn)不斷上升和年輕化的趨勢。2010年中國糖尿病患者近9 200萬[1]，目前全球糖尿病患者已增至3.66億人，根據(jù)預(yù)測，20年內(nèi)將達(dá)到近6億人，全球每年死于糖尿病的人數(shù)約為460萬，用于糖尿病患者的醫(yī)療開支共計4 650億美元。因此，糖尿病的防治任重道遠(yuǎn)。糖尿病主要分為1型和2型，共同的病理生理學(xué)特征是胰島β細(xì)胞數(shù)目減少和(或)功能障礙。因此，胰島β細(xì)胞的發(fā)育與再生一直是糖尿病領(lǐng)域的研究前沿和熱點，該方面的研究進(jìn)展可能為糖尿病的防治帶來新的突破。本文就胰島β細(xì)胞發(fā)育與再生的最新研究進(jìn)展做一綜述。

1　胰島β細(xì)胞的發(fā)育

1.1胰腺的組成胰腺由外分泌部和內(nèi)分泌部構(gòu)成。外分泌部由腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞構(gòu)成。胰腺內(nèi)分泌部主要由散在胰腺各部的胰島和在胰腺外分泌細(xì)胞中的內(nèi)分泌細(xì)胞構(gòu)成。胰島是胰腺的主要內(nèi)分泌組織，主要有5種類型的細(xì)胞，即α、β、δ、PP和ε細(xì)胞，分別分泌胰高血糖素、胰島素、生長抑素、胰多肽和生長激素釋放肽。其中α細(xì)胞約占胰島細(xì)胞的15%～20%，β細(xì)胞占70%～80%，δ細(xì)胞占5%，PP 細(xì)胞占1%，ε細(xì)胞﹤1%。在多數(shù)哺乳類動物中，內(nèi)分泌細(xì)胞在胰島內(nèi)的分布相似，其特點是β細(xì)胞位于核心，而周圍由非β細(xì)胞(α細(xì)胞和δ細(xì)胞)構(gòu)成非連續(xù)性框架。人類和靈長類的胰島形狀及排列更加復(fù)雜，輪廓有橢圓形和三葉草形等多種形態(tài)。

1.2胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的分化人體內(nèi)分泌細(xì)胞來源于導(dǎo)管樣上皮細(xì)胞，于孕第7周開始分化；第12周時，胰島細(xì)胞增多并離開導(dǎo)管上皮遷移到導(dǎo)管旁的間充質(zhì)內(nèi)聚集，形成原始胰島；第14周時，胰腺間充質(zhì)大量增生，分隔胰腺組織形成胰腺小葉，胰島形成并繼續(xù)保持高速增殖分化直到出生。出生后，胰島經(jīng)歷了β細(xì)胞復(fù)制、增生及凋亡的重塑過程。出生階段，β細(xì)胞群體中每天約有18% β細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制增殖，使β細(xì)胞數(shù)量增多，以適應(yīng)合成胰島素的需要。成年后，β細(xì)胞的復(fù)制率占總數(shù)的2%～3%。胰島通過凋亡和增殖的平衡來維持β細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定[2]。

2　胰島β細(xì)胞分化的分子機(jī)制

研究證明，參與胰島β細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子主要包括胰十二指腸同源異型盒蛋白1(pancreatic duodenal homeobox 1，Pdx1)、神經(jīng)元素3(neurogenin 3，Ngn3)、激活素A(activin A)、配對盒基因4(paired homeobox gene 4,Pax4)、NK2轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的基因座2(NK2 transcription factor related, locus 2,Nkx2.2)及NK6轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的基因座1(NK6 transcription factor related, locus 1,Nkx6.1)等，這些蛋白協(xié)調(diào)表達(dá)決定了胰島β細(xì)胞的分化。

2.1Pdx1Cerf等[3]研究認(rèn)為Pdx1是表達(dá)于早期胰腺發(fā)育、胰島細(xì)胞分化和β細(xì)胞成熟過程中的一個重要的轉(zhuǎn)錄因子。Pdx1誘導(dǎo)內(nèi)胚層向胰腺定向發(fā)育和成熟, 其活化可促進(jìn)胰島素、生長抑素、葡萄糖激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運子2和胰島淀粉樣多肽等β細(xì)胞重要基因的表達(dá)，并可誘導(dǎo)內(nèi)源性生長激素抑制激素基因的表達(dá)，是胰腺開始形成的標(biāo)志；促進(jìn)胰島素分泌和維持胰島β細(xì)胞的正常功能, 其對出現(xiàn)在腸內(nèi)胚層背側(cè)及腹側(cè)的胰腺萌芽的生長分化起重要作用，其純合子缺失突變會導(dǎo)致胰腺無法形成[2]。

2.2Ngn3Ngn3是堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族轉(zhuǎn)錄因子，屬于胰島祖細(xì)胞的特異性表達(dá)基因之一，在胚胎內(nèi)臟內(nèi)胚層新生內(nèi)分泌胰腺中起重要作用[4]。上調(diào)其下游基因神經(jīng)源性分化因子1(neurogenic diffe-rentiation factor 1,NeuroD1)表達(dá)，Pax4/6等可促進(jìn)胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)對β細(xì)胞的分化作用。Melton實驗室利用重組腺病毒將Ngn3、Pdx1及肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A基因 (v-mafmusculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene ho-molog A,MafA)聯(lián)合作用可在體內(nèi)不需要重新編程即可將外分泌腺的胰腺泡細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成β細(xì)胞[5]。此外，Ngn3對本身的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用，當(dāng)Ngn3通過激活胰島素細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)胰島細(xì)胞分化時，Ngn3也抑制本身基因的表達(dá)[6]。

2.3Activin AActivin A屬于TGF-β超家族成員。不同濃度的activin A可使胚胎干細(xì)胞向不同胚層細(xì)胞分化[7]。Activin A在胚胎干細(xì)胞向胰島素生成細(xì)胞分化的過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。Kitamura等[8]發(fā)現(xiàn)，一種植物堿藥物conophylline(CnP)和β細(xì)胞素δ4(betacellulin-δ4,BTCδ4)可以使β細(xì)胞分化，二者比用activin A和β細(xì)胞素(betacellulin)更能有效誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的產(chǎn)生，且分化成的β細(xì)胞更能應(yīng)答高血糖刺激，說明CnP是一種比activin A更為有效的誘導(dǎo)胰島細(xì)胞生成的因子。

2.4Pax4Pax4是成對-同源框基因家族成員，在胰腺早期分化及成熟胰島細(xì)胞增殖過程中起重要的作用。早期在胚胎胰芽中表達(dá)，晚期局限于分化的β細(xì)胞中，胰腺發(fā)育成熟后，不再表達(dá)[9]。Pax4對胰島素和生長抑素產(chǎn)生細(xì)胞分化是必要的, 促進(jìn)β和δ細(xì)胞的發(fā)育。

2.5Nkx2.2與Nkx6.1Nkx2.2和Nkx6.1是NK2型同源盒基因家族成員。Nkx2.2在腹側(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胰腺中表達(dá)。Nkx2.2從胚胎胰腺8.5 d即在腹側(cè)和背側(cè)胰芽中表達(dá)。胰島發(fā)育完全后，在除δ細(xì)胞外的所有胰島細(xì)胞中表達(dá)，它對于表達(dá)胰島素是必需的[10]。Nkx2.2是下游的調(diào)控因子，保證定向分化形成的內(nèi)分泌細(xì)胞具有內(nèi)分泌作用。Nkx2.2是β細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，對于β細(xì)胞的最終分化是必要的。Nkx6.1位于Nkx2.2下游，是一個特異表達(dá)于成熟β細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子。最早于胚胎9.0～9.5 d在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中表達(dá)，后來特異局限于成熟的β細(xì)胞，Nkx6.1在β細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。

3　胰島β細(xì)胞的變化與糖尿病的關(guān)系

糖尿病是一種以血漿葡萄糖水平升高為基本特征的代謝性疾病。1型糖尿病患者因免疫損傷、β細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行性喪失及胰島素分泌不足導(dǎo)致血糖持續(xù)升高。2型糖尿病患者同時存在胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗，存在β細(xì)胞數(shù)量的丟失或功能不足，致胰島素總量不足或生物效應(yīng)的降低，引起血糖升高[11]。不論是1型還是2型糖尿病，最終在多因素?fù)p害下均會導(dǎo)致β細(xì)胞衰竭，β細(xì)胞的分泌缺陷和數(shù)量缺失可導(dǎo)致胰島素供給缺乏，機(jī)體代謝障礙。糖尿病早期，β細(xì)胞功能損害尚部分可逆，但到了晚期，由于胰島數(shù)量和β細(xì)胞總量減少，功能衰退發(fā)展為不可逆[12]。因此，早期消除或減輕各種損害β細(xì)胞的因素，逆轉(zhuǎn)其衰竭，晚期增加β細(xì)胞數(shù)量和提升其質(zhì)量是解決糖尿病損害的關(guān)鍵途徑之一。

現(xiàn)有證據(jù)表明，β細(xì)胞群是不斷變化的，通過β細(xì)胞功能和大小數(shù)量的變化使血糖濃度局限在一個很狹窄的生理范圍內(nèi)[3]。β細(xì)胞群大小數(shù)量的增加或減少可能與β細(xì)胞數(shù)量(增殖或凋亡)和單個細(xì)胞體積(肥大或萎縮)的變化有關(guān)。在肥胖、妊娠等情況下，胰島細(xì)胞的數(shù)量和胰島的體積都明顯增加，妊娠大鼠的β細(xì)胞數(shù)量比正常時增加50%。胰島素受體或胰島素受體底物1基因敲除的小鼠，其血漿胰島素水平比正常小鼠高數(shù)十倍。同時，其β細(xì)胞的數(shù)量約是正常小鼠的數(shù)十倍[13]。這種細(xì)胞數(shù)量的增加是一種有效的功能代償形式，其機(jī)制可能包括β細(xì)胞的增生增加、凋亡減少和胰島的再生。

4　胰島β細(xì)胞再生的細(xì)胞來源

4.1成熟β細(xì)胞Dor等[14]發(fā)現(xiàn)在正常的生理或胰腺部分切除后(70%)，新的β細(xì)胞是由已經(jīng)存在的成熟β細(xì)胞復(fù)制或有絲分裂形成的，并不是由其干細(xì)胞或者祖細(xì)胞分化發(fā)育而來。從而直接證明終末分化的小鼠β細(xì)胞仍具有增殖能力。β細(xì)胞的復(fù)制主要是在胰島內(nèi)部，胰島的體積會隨著β細(xì)胞復(fù)制而增加，并沒有新的胰島生成。Spijker等[15]發(fā)現(xiàn)成熟內(nèi)分泌細(xì)胞的可塑性能夠被調(diào)控。在沒有引入基因突變修飾的情況下，初始人類β細(xì)胞經(jīng)歷了一個轉(zhuǎn)變過程而成為產(chǎn)生胰高血糖素的α細(xì)胞。慢病毒介導(dǎo)的β細(xì)胞譜系跟蹤揭示，這個轉(zhuǎn)變過程在幾天內(nèi)發(fā)生。在超微結(jié)構(gòu)形態(tài)的基礎(chǔ)上，已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與原始α細(xì)胞難以區(qū)分，且移植體內(nèi)后能維持α細(xì)胞的表型。隨著β細(xì)胞脫顆粒和產(chǎn)生胰高血糖素細(xì)胞內(nèi)β細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Pdx1及Nkx6.1的表達(dá)，β細(xì)胞轉(zhuǎn)變成α細(xì)胞。

4.2胰島α細(xì)胞Thorel等[16]使用白喉毒素(diphtheria toxin,DT)將RIP-DTR小鼠的胰島β細(xì)胞幾乎全部破壞，誘發(fā)糖尿病，并采用遺傳譜系追蹤標(biāo)記監(jiān)測方法在6個月后發(fā)現(xiàn)胰島β細(xì)胞再生，數(shù)量增加，并且是由α細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。Maria-Engler等[13]也發(fā)現(xiàn)胰島α細(xì)胞可以向β細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其中Pdx1、Nkx6.1和Pax4起了關(guān)鍵作用，并且胰島α細(xì)胞和β細(xì)胞有共同的轉(zhuǎn)錄因子(如Isl1和Pax6)和起源。Talchai等[17]發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病β細(xì)胞功能衰竭的過程中，β細(xì)胞去分化轉(zhuǎn)變?yōu)棣良?xì)胞是其中的重要機(jī)制。這些研究結(jié)果表明，胰島α細(xì)胞和β細(xì)胞在特定的病理生理條件下，可能存在交互轉(zhuǎn)分化過程。

4.3胰腺導(dǎo)管前體細(xì)胞胰腺導(dǎo)管細(xì)胞可能是胰島的前體細(xì)胞。采用共聚焦顯微和微量RT-PCR方法證實，長期培養(yǎng)巢蛋白陽性的胰島細(xì)胞，可被視為前體細(xì)胞分化為完全功能β細(xì)胞的潛在來源[18]。Phinney等[19]在體外定向誘導(dǎo)成人胰腺導(dǎo)管細(xì)胞分化為分泌胰島素的功能性胰島細(xì)胞團(tuán)。Bonner-Weir等[20]從人胰腺導(dǎo)管中誘導(dǎo)分化出有組織結(jié)構(gòu)的胰島樣細(xì)胞團(tuán)(cultured human islet buds,CHIBs)，CHIBs可根據(jù)葡萄糖刺激產(chǎn)生胰島素分泌。

4.4胰腺腺泡細(xì)胞Furuya等[21]發(fā)現(xiàn)，配體結(jié)合的甲狀腺激素受體α(thyroid hormone receptor α,TRα)在β細(xì)胞數(shù)量的后天擴(kuò)增生長過程中起著關(guān)鍵作用。使用能表達(dá)TRα的腺病毒載體去誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞的重新編碼而使其轉(zhuǎn)變成產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞，其中TRα是由淀粉酶2啟動子(AdAmy2TRα)調(diào)控的。用3,5,3′-三碘甲狀腺原氨酸的治療增加了TRα與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)亞基p85α的聯(lián)系，在純化的腺泡細(xì)胞中，磷酸化絲/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase,Akt)致其活化，從而促進(jìn)Pdx1、Ngn3和MafA表達(dá)?；谀叵嚓P(guān)細(xì)胞譜系示蹤系統(tǒng)和Cre/loxP位點細(xì)胞譜系示蹤系統(tǒng)的分析，表明新合成的產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞來源于胰腺腺泡細(xì)胞。經(jīng)電子顯微鏡觀察到細(xì)胞中含有胰島素的分泌顆粒。由小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)介導(dǎo)的p85α沉默或由LY294002誘導(dǎo)的PI3K抑制，揭示了的Pdx1、Ngn3和MafA的表達(dá)和產(chǎn)生胰島素細(xì)胞的重新編碼。

4.5胚胎干細(xì)胞Schuldiner等[22]發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞可以在體外自發(fā)分化為能夠產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞，但效率非常低(1%～2%)。Segev等[23]應(yīng)用H9.2胚胎干細(xì)胞系在體外經(jīng)過6個不同階段的分化，形成了胰島樣細(xì)胞團(tuán)。Kroon等[24]發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞成熟時可生成一種相應(yīng)于胰腺內(nèi)胚層的細(xì)胞，其能夠保持血糖接近正常水平，但得到的內(nèi)分泌細(xì)胞會有一些不成熟的表型，可能形成畸胎瘤。因所獲得胰島樣細(xì)胞分泌胰島素水平低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到β細(xì)胞的功能，以及倫理學(xué)問題等限制了胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用。

4.6骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)是來源于中胚層的具有自我更新和分化潛能的多能干細(xì)胞，能夠向胰島樣細(xì)胞分化，促進(jìn)受體殘余胰島增殖。Moriscot等[25]發(fā)現(xiàn)hBMSCs能夠分化為胰島素分泌細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR檢測肝核轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白A2(forkhead box protein A2,FoxA2)和胰島素啟動因子1在誘導(dǎo)其分化過程中起重要作用。唐小龍等[26]研究發(fā)現(xiàn)Pdx1聯(lián)合Nkx6.1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞。Sun等[27]研究證實，即使是糖尿病患者的hBMSCs，也可以在體外誘導(dǎo)成胰島素生成細(xì)胞，自體移植后可有效避免排斥反應(yīng)，這種hBMSCs表達(dá)CD29、CD44和CD106。

4.7臍帶血干細(xì)胞臍帶血所含淋巴細(xì)胞的免疫功能不夠成熟，體內(nèi)移植能逃避主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)不相容的免疫細(xì)胞攻擊。研究證實，臍血中除了富含造血干細(xì)胞，還含有多潛能干細(xì)胞-間充質(zhì)干細(xì)胞。Michael等[28]經(jīng)外周靜脈為15位1型糖尿病患兒實施臍血自體移植術(shù)，移植后患兒內(nèi)源性胰島素分泌衰退的速度減慢，沒有明顯不良反應(yīng)。蘇仲春等[29]使用細(xì)胞外基質(zhì)膠將人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)分化為胰島素分泌細(xì)胞，可見細(xì)胞團(tuán)樣結(jié)構(gòu)，胰島素陽性細(xì)胞占所誘導(dǎo)細(xì)胞的(25.2±3.4)%，誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)胰島相關(guān)基因和激素。

4.8脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)脂肪組織來源方便，且含有大量的間充質(zhì)干細(xì)胞。Chandra等[30]采用分步誘導(dǎo)法，將ADSCs誘導(dǎo)成能分泌胰島素的胰島樣細(xì)胞。印度學(xué)者用ADSCs結(jié)合骨髓移植治療了5例1型糖尿病患者，發(fā)現(xiàn)患者胰島素的需求降低，血液C-肽水平提高了4～26倍，且平均維持在3個月左右。研究表明用人的ADSCs結(jié)合骨髓移植治療1型糖尿病比較安全，沒有出現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)，也避免了異基因的污染[31]。

4.9誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS細(xì)胞)2006年，Takahashi等[32]向鼠胚或成體成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入4個特定的轉(zhuǎn)錄因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc及Klf4)產(chǎn)生出iPS細(xì)胞。經(jīng)過篩選，發(fā)現(xiàn)了具有干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞群落和具有胚胎干細(xì)胞特異的表面抗原，通過檢測充分證明了它們具有多能性。2009年，“小小”的誕生再次證明了iPS細(xì)胞的全能性[33]。Zhang等[34]將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的產(chǎn)胰島素細(xì)胞，大部分表達(dá)與成熟β細(xì)胞相同的特異標(biāo)記，如Nkx6.1和Pdx1。2010年7月，Seki等[35]研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(T-cellderived iPS cells,TiPS cells) 保留了T淋巴細(xì)胞受體的基因組重排，并且其受體基因座重排可作為一種基因簽名用于體內(nèi)示蹤。iPS細(xì)胞具有許多獨特的優(yōu)點，如來源不受限制，避免了免疫排斥反應(yīng)以及倫理道德等問題，保證了其具有廣泛的應(yīng)用前景，然而致瘤性是其致命的缺陷，安全性、有效性仍需進(jìn)一步驗證。

5　展望

目前關(guān)于通過胰腺成熟細(xì)胞、干細(xì)胞等來源定向分化為β細(xì)胞的多種途徑的研究已經(jīng)取得了一定的成果，從而有希望在根本上解決β細(xì)胞來源不足的問題，為臨床糾正糖尿病患者的β細(xì)胞功能缺陷提供有效手段。但如何解決定向誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的功能性β細(xì)胞，克服排斥反應(yīng)，避免自身免疫反應(yīng)的攻擊以及干細(xì)胞致瘤性等問題仍是一個巨大挑戰(zhàn)。隨著干細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，相信將來肯定能克服以上困難，掌握一套成熟的技術(shù)用于臨床治療攻克糖尿病。

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