PCR法與培養(yǎng)法在檢測(cè)解脲支原體中的兩種方法比較

邱華琴 洪麗梅 林 萍

（解放軍第184醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 鷹潭 335000）

PCR法與培養(yǎng)法在檢測(cè)解脲支原體中的兩種方法比較

邱華琴 洪麗梅 林 萍

（解放軍第184醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 鷹潭 335000）

目的對(duì)PCR法與培養(yǎng)法在檢測(cè)解脲支原體中的兩種方法進(jìn)行比較。方法選取了2011年1月至2012年6月期間，來自我院診治的158份樣本，并對(duì)其進(jìn)行了PCR法和培養(yǎng)法測(cè)試比較，以對(duì)兩種檢測(cè)方法的敏感性及特異性進(jìn)行比較。結(jié)果PCR法檢出陽性率為70.3%；培養(yǎng)法檢出陽性率為43.0%。經(jīng)配對(duì)計(jì)數(shù)和χ2檢驗(yàn)，PCR法的敏感性明顯高于培養(yǎng)法（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)CR較培養(yǎng)液法具有更高的敏感性，值得在實(shí)驗(yàn)條件較好的醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行推廣應(yīng)用。

PCR；培養(yǎng)法；解脲支原體

臨床常見的慢性前列腺炎、非淋菌性尿道炎、陰道炎、附睪炎、宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、不育等疾病都和解脲支原體（UU）有著緊密的聯(lián)系。此外解脲支原體還會(huì)從母體垂直傳染給胎兒，從而導(dǎo)致嬰兒出現(xiàn)腦膜炎、皮下脹腫等疾病[1]。目前，臨床上已將解脲支原體作為非淋菌性尿道炎的重要診斷指標(biāo)之一。檢測(cè)解脲支原體最傳統(tǒng)的方式即是培養(yǎng)法，此外，為了適應(yīng)臨床診斷及研究發(fā)展的需求，PCR擴(kuò)增法也被用于檢測(cè)解脲支原體。本文選取了2011年1月至2012年6月期間，來自我院診治的158份標(biāo)本，并對(duì)其進(jìn)行了PCR法和培養(yǎng)法測(cè)試比較，以對(duì)兩種檢測(cè)方法的敏感性及特異性進(jìn)行比較。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

樣本來源是于2011年1月至2012年6月在我院就診的158例泌尿科、性病?？坪蛬D科患者，其中32例為男性，126例為女性；年齡為16～47歲。經(jīng)確診，上述患者具體病情為：12例為性病，55例為陰道炎，69例為盆腔炎，22例為前列腺炎。根據(jù)樣本采集的相關(guān)指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)，臨床醫(yī)師對(duì)每例患者各采集兩份樣本，分別進(jìn)行PCR檢測(cè)和培養(yǎng)檢測(cè)。

2 試劑來源及儀器：

2.1 試劑

PCR測(cè)定試劑為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，培養(yǎng)法所用試劑有珠海迪爾生物工程有限公司提供的支原體（Uu/Mh）分離培養(yǎng)藥敏試劑盒。

2.2 儀器

DA7600擴(kuò)增儀。

2.3 檢測(cè)方法

PCR方法：首先把標(biāo)本放進(jìn)1.5mL的消毒離心管中，加入1mL無菌生理鹽水，浸潤(rùn)10min，隨后進(jìn)行徹底的清洗，把棉拭子上的分泌物徹底洗于生理鹽水內(nèi)，將棉拭子擠干，丟棄。將所得溶液以12 000rpm離心5min，將上清液去除，在沉淀中加入50μL DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理（10±1）min，12，000rpm離心5min，取2μL上清液加入含（UU）的Taq進(jìn)行PCR反應(yīng)。另分別取100μL陰陽性對(duì)照質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，與等量提取液充分混合、恒溫浴、離心及PCR反應(yīng)等與上述操作相同。按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品，陽性定量參考品以及樣本。設(shè)置循環(huán)條件；：93℃→2min，93℃ 45s→55℃ 60s→10個(gè)循環(huán)，93℃ 30s→55℃ 45s→30個(gè)循環(huán)。保存文件，運(yùn)行。反應(yīng)結(jié)束后通過曲線分析直接得出標(biāo)本的數(shù)值。

解脲支原體培養(yǎng)：將采集的標(biāo)本拭子插入培養(yǎng)瓶，在靠近液面上方的瓶壁擠壓旋轉(zhuǎn)拭子數(shù)次，使拭子中樣本滲入；若為精液、前列腺液標(biāo)本，取200μL加入培養(yǎng)基中；若為中段尿，經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分離心10min，取沉渣100μL加入培養(yǎng)基中。充分混勻接種標(biāo)本中的培養(yǎng)基，取100μL加入檢測(cè)卡的各孔中（除C-孔）。 各孔滴加2滴無菌礦物油，蓋上檢測(cè)卡蓋，置35℃～37℃孵箱培養(yǎng)，在24h和48h分別觀察結(jié)果。經(jīng)48h培養(yǎng)，如果培養(yǎng)液顏色沒有改變則為陰性，如果培養(yǎng)基顏色從黃色變成紅色則為解脲支原體陽性。。

2 結(jié) 果

經(jīng)檢驗(yàn)，PCR法檢出111例為陽性，47例為陰性，陽性率為70.3%；培養(yǎng)法檢出68例為陽性，90例為陰性，陽性率為43.0%。在檢測(cè)中，有18例樣本經(jīng)培養(yǎng)法檢測(cè)顯示陰性，PCR法檢測(cè)結(jié)果為陽性；另有8例樣本經(jīng)PCR檢測(cè)顯示陰性，但是培養(yǎng)法檢測(cè)為陽性。經(jīng)配對(duì)計(jì)數(shù)和χ2檢驗(yàn)，PCR法的敏感性明顯高于培養(yǎng)法（P＜0.05）。

3 討 論

解脲支原體檢測(cè)方法有固體培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法和分子生物熒光定量PCR法，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。固體培養(yǎng)法是直接通過培養(yǎng)分離出該病原體菌落，進(jìn)行系統(tǒng)鑒定而得出結(jié)論，可謂金標(biāo)準(zhǔn)，但實(shí)驗(yàn)條件要求較高費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，不適合常規(guī)檢查[2]，目前檢測(cè)該病原體主要是液體培養(yǎng)法和PCR法，液體培養(yǎng)法是利用解脲支原體中的脲酶能分解培養(yǎng)基中的尿素，使PH值上升使酚紅指示劑由黃變?yōu)榧t色，而進(jìn)行判斷為解脲支原體陽性，此法操作簡(jiǎn)單而且可以同時(shí)做藥敏試驗(yàn)。這點(diǎn)是定量PCR法無法比擬的。PCR法是直接檢測(cè)病原體的核酸進(jìn)行判斷是否有該病原體存在，為目前比較理想的方法。且其特異性、敏感性、準(zhǔn)確性較高而且檢測(cè)時(shí)間短。解脲支原體培養(yǎng)基中包含酚紅指示劑及尿素，因解脲支原體中的脲酶會(huì)分解尿素，生產(chǎn)NH4和CO2，使培養(yǎng)液趨向堿性，酚紅指示劑從而變成為紅色[2]。然而，泌尿系統(tǒng)和生殖道其它的微生物內(nèi)也存在脲酶，可導(dǎo)致假陽性結(jié)果，特別是女性的支原體培養(yǎng)標(biāo)本都是宮頸分泌物其本身就不同程度帶有細(xì)菌，本文對(duì)8例經(jīng)PCR檢測(cè)顯示陰性但培養(yǎng)法檢測(cè)為陽性的標(biāo)本進(jìn)行了鑒定，造成該情況的原因可能是引起培養(yǎng)物顏色變化的因素未必皆為支原體，變形桿菌、腸桿菌、克雷伯氏菌及酵母菌等污染均可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性。

綜上所述，在對(duì)解脲支原體的檢測(cè)中，PCR檢測(cè)法具有敏感度及特異性較高、操作方便、檢測(cè)周期短等優(yōu)勢(shì)，最重要的是通過PCR的測(cè)定可以給臨床醫(yī)師提供最直觀的療效評(píng)叛，然而此法對(duì)檢測(cè)技術(shù)要求及實(shí)驗(yàn)條件有著較高的要求，如果實(shí)驗(yàn)室條件不足，則其檢測(cè)結(jié)果也會(huì)受到一定的影響。因此，PCR較培養(yǎng)液法具有更高的敏感性，值得在實(shí)驗(yàn)條件較好的醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行推廣應(yīng)用。

[1] 周才麗,胡燕玲.熒光定量PCR法與培養(yǎng)法在檢測(cè)解脲支原體中的比較[J].現(xiàn)代診斷與治療,2011,22(2):107-108.

[2] 王玉珍,蘆偉.培養(yǎng)法及PCR法用于解脲支原體檢測(cè)結(jié)果的分析[J].醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究,2006,8(3):108-109.

R446

B

1671-8194（2013）16-0195-02