皮膚抗氧化功效評價動物模型及替代方法

步 犁，程樹軍，秦 瑤，談偉君

(1.廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州 5103101;2.廣東檢驗檢疫技術(shù)中心，廣州 510623)

皮膚是各種理化因素?fù)p傷的重要靶組織，如紫外線與環(huán)境污染物的不良影響可能造成皮膚結(jié)構(gòu)和功能的損傷。越來越多的證據(jù)表明皮膚氧化與抗氧化穩(wěn)態(tài)的失衡與皮膚老化、干燥、色素沉著等直接相關(guān)，而過敏性皮炎、色斑形成等嚴(yán)重皮膚病變也與氧化損傷密切相關(guān)［1］。近年來，有關(guān)皮膚氧化損傷與防護的概念已深入人心，各種宣稱具有抗氧化功效的皮膚護理產(chǎn)品深受消費者歡迎，開發(fā)抗氧化植物提取物和活性配方成為產(chǎn)品研發(fā)的熱點。因此如何在傳統(tǒng)動物模式的基礎(chǔ)上，建立更加快速、有效而且與人體皮膚相關(guān)性更高的檢測方法非常重要。

1 皮膚氧化應(yīng)激原與檢測指標(biāo)

氧化損傷主要通過內(nèi)源性和外源性兩方面產(chǎn)生，造成氧化損傷的主要物質(zhì)是活性氧族(ROS)。內(nèi)源性ROS主要來源于有氧氧化的副產(chǎn)品和細(xì)胞炎癥反應(yīng)。外源性ROS主要來源于紫外線輻射和環(huán)境污染物的刺激，由于人類生存環(huán)境的惡化和化合物不合理利用，使得皮膚接觸各種污染物的機率比以往增加，重金屬、顆粒物、紫外線照射、電磁輻射、化學(xué)有機試劑等遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其環(huán)境本底濃度，這些污染物與人體皮膚接觸，除了本身就是氧化劑或具有氧化活性外，有的可催化和加速氧化應(yīng)激的生物學(xué)過程。

目前用于研究皮膚氧化應(yīng)激的最多因素是紫外線，包括UVA和UVB，UVB照射主要引起表皮細(xì)胞DNA損傷，蛋白質(zhì)氧化和誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性，UVA照射則引起真皮層細(xì)胞的損傷，與皮膚彈性喪失和光老化相關(guān)。兩種波長的紫外線均能誘發(fā)ROS的產(chǎn)生，進而引起皮膚的深層次傷害［2］。近年來，植物源性抗氧化劑之所以引起關(guān)注，主要原因與其能清除ROS和抑制UV誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路的作用有關(guān)。許多研究表明化妝品中合理添加抗氧化劑，或在皮膚疾病治療中使用含抗氧化成份的產(chǎn)品可有效阻止紫外線介導(dǎo)的皮膚損傷。

多種模擬人體皮膚環(huán)境生態(tài)暴露的危害因子成為新的研究對象，例如大氣污染物、有害氣體等。研究發(fā)現(xiàn)光化學(xué)煙霧中的臭氧是重要的皮膚氧化應(yīng)激源，它可攻擊皮脂和細(xì)胞膜脂中的多不飽和脂肪酸，誘發(fā)產(chǎn)生的醛、羥基過氧化物和自由基可造成皮膚功能受損［3］。

皮膚組織中促氧化過程和抗氧化防御系統(tǒng)的失衡造成了細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)穩(wěn)態(tài)的紊亂，最終導(dǎo)致皮膚氧化應(yīng)激和損傷的后果。因此，氧化產(chǎn)生的自由基，以及受自由基攻擊的靶點及其變化是檢測的主要指標(biāo)。這些指標(biāo)包括:細(xì)胞DNA突變或表達(dá)衰老蛋白增加，細(xì)胞毒性作用通路的級聯(lián)反應(yīng)，多種細(xì)胞器的直接損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體應(yīng)激等。另一方面，正常皮膚防御體系的消長也是常用檢測指標(biāo)，包括抗氧化酶類(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶)、蛋白性抗氧化劑(谷胱甘肽、銅藍(lán)蛋白、金屬硫蛋白等)等［4］。隨著皮膚氧化機制認(rèn)識的深入，更多基于細(xì)胞、基因或蛋白水平的敏感而特異的檢測指標(biāo)將得到開發(fā)。

2 皮膚抗氧化評價的動物模型

動物模式的抗氧化測試方法包括局部皮膚損傷模型、疾病模型和轉(zhuǎn)基因動物模型，主要用于抗氧化機制研究和疾病治療研究，以闡明氧化損傷與疾病的關(guān)系。

2.1 紫外線照射模型

在誘導(dǎo)動物皮膚氧化應(yīng)激方面，紫外線是最常用的造模工具。動物常選用是豚鼠、C3H/HeNTac小鼠或無毛轉(zhuǎn)基因小鼠。多以模擬某一波長的紫外線進行局部照射，如UVB照射造成皮膚老化和紫外線損傷。在此之前或之后涂抹一段時間的抗氧化物質(zhì)，隨后處死動物，將動物皮膚剝離，采用毛細(xì)管氣相色譜法、電子捕獲技術(shù)或病理切片等進行組織內(nèi)損傷分析，或采用組織勻漿法測量組織內(nèi)SOD、GSH、GSHPx等指標(biāo)衡量氧化應(yīng)激反應(yīng)的情況［5］。

動物全身暴露于紫外線照射下首先會產(chǎn)生皮膚的氧化損傷效應(yīng)，朱彥君［6］等建立的無毛小鼠皮膚光老化模型，動物皮膚經(jīng)UVB照射后應(yīng)用皮膚圖像分析系統(tǒng)、皮膚組織學(xué)及特殊染色方法對皮膚紋理、表皮、真皮、基底膜、粘多糖、膠原纖維、彈性纖維等變化進行對比觀察。此外暴露也會產(chǎn)生其它的全身性反應(yīng)，如干擾免疫系統(tǒng)和情緒反應(yīng)。因此，動物模型在研究包括皮膚在內(nèi)的全身系統(tǒng)反應(yīng)方面具有一定優(yōu)勢。例如研究氧化損傷中免疫系統(tǒng)所起的作用，利用動物模型研究體內(nèi)不同激素水平對紫外線照射后皮膚變化的影響，探討雌激素在拮抗紫外線損傷中的作用，還可綜合考量受試物經(jīng)皮膚及動物體內(nèi)代謝變化的影響。

但是，利用動物模型檢測氧化指標(biāo)的缺陷也是顯而易見的。首先，紫外線照射會產(chǎn)生一定熱量，動物體積小，熱量代謝的速度與途徑與人體不同，這會使某些對溫度敏感的指標(biāo)發(fā)生變化;其次，動物試驗影響因素較多，這給單純評價紫外線皮膚損傷后果帶來不便，如雌激素是已知的可拮抗紫外線作用的物質(zhì)，如采用雌性動物則無法單獨評估紫外線的損傷作用;再次，由于動物皮膚對紫外線的耐受性與人不同，往往使用動物造模時不能一次性達(dá)到目標(biāo)的劑量，需要反復(fù)照射，易造成動物的生理和情緒應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激和束縛應(yīng)激均會對小鼠的凝血系統(tǒng)產(chǎn)生影響，推測也會對抗氧化指標(biāo)產(chǎn)生影響。

2.2 物理及化學(xué)物刺激模型

物理刺激造成氧化應(yīng)激的常用方法包括缺氧法、剝奪睡眠法和高溫暴露法，造成動物整體生理代謝產(chǎn)生氧化應(yīng)激的狀態(tài)?；瘜W(xué)物刺激可分為直接皮膚涂抹造成皮膚炎癥和腹腔注射法造成全身反應(yīng)。根據(jù)實驗?zāi)康牟煌x用的化學(xué)變應(yīng)原也不同，例如，1%的2，4-二硝基氯苯(DNCB)涂抹小鼠皮膚，可造成變應(yīng)性皮炎，腹腔注射黃嘌呤氧化酶加次黃嘌呤造成全身氧化應(yīng)激［7］。物理法及化學(xué)物刺激法在運動學(xué)和職業(yè)衛(wèi)生領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛，便于模擬各種非正常狀態(tài)下的暴露;但是這兩類造模方法會造成動物極大的痛苦，動物的個體差異也會影響實驗的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

2.3 全身抗氧化模型

全身抗氧化功能評價主要用于保健食品，需要測試動物使用產(chǎn)品一段時間后血液的抗氧化水平，但易受到外界因素的干擾。體內(nèi)動物試驗的結(jié)果存在人群外推的風(fēng)險，經(jīng)口攝入途徑的食品抗氧化能力的測試方法也不適用于皮膚表面使用產(chǎn)品的抗氧化水平的測試。動物試驗普遍周期較長、成本高，不適用于大量活性原料篩查和成品功效評估。而且，目前化妝品的開發(fā)趨勢已轉(zhuǎn)向多種功能的復(fù)配組合，如美白、防曬、保濕、除皺等功能性化妝品均不同程度具有抗氧化功效，利用動物模式評估這些綜合效果顯然是不合適的。因為這些產(chǎn)品的最終目的是為了改善人體皮膚結(jié)構(gòu)和功能，但人與動物的皮膚結(jié)構(gòu)存在差異，代謝途徑及方法亦有所不同，因此動物試驗結(jié)果與人體試用結(jié)果不具有可比性。

3 動物替代方法

皮膚氧化與抗氧化穩(wěn)態(tài)的失衡是導(dǎo)致皮膚亞健康問題的重要因素，氧化應(yīng)激可從多個方面造成細(xì)胞、組織、器官的損傷。大多數(shù)觀點認(rèn)為自由基是造成皮膚氧化損傷的元兇，因而現(xiàn)階段多數(shù)評價方法把檢測自由基水平的降低或清除自由基的能力認(rèn)為是抗氧化功效的證據(jù)，這些檢測系統(tǒng)包括化學(xué)方法、臨床方法、細(xì)胞方法。

3.1 化學(xué)方法

化學(xué)方法通常以易于氧化的底物為測試系統(tǒng)，加入氧化物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成氧化產(chǎn)物(如各種活性氧和自由基)，然后加入抗氧化劑檢測其自由基清除能力作為判斷依據(jù)?；瘜W(xué)檢測法具有快速、低成本的優(yōu)點，可實現(xiàn)大量樣本的快速篩查，缺點是反應(yīng)體系過于單一，標(biāo)準(zhǔn)化程度不高，檢測結(jié)果與體內(nèi)實際應(yīng)用效果存在差異。

3.2 臨床試驗

基于人體志愿者的臨床功效試驗主要用于終產(chǎn)品的評價，不僅可進行皮膚抗氧化產(chǎn)品的評價，還可評估抗氧化劑對其它功效作用(如保濕、防曬、美白、去皺)的相關(guān)性。通過試用產(chǎn)品后總的皮膚抗氧化水平監(jiān)測和總體皮膚功能改善情況綜合反應(yīng)產(chǎn)品的性能。其優(yōu)點表現(xiàn)在能夠在宏觀水平監(jiān)測皮膚氧化的結(jié)果，包括皮膚結(jié)構(gòu)和特性的改變，如水份流失下降、皮下膠原蛋白重建、色素沉著變淺，以及皮膚光澤度、光滑性和紋理的改善等。使用針對性強和靈敏度高的非介入測試儀器可以了解上述皮膚功能的變化，如全臉分析系統(tǒng)和色斑定量分析系統(tǒng)可綜合判斷產(chǎn)品試用前后皮膚色素沉積的改善變化［8］。臨床試驗的缺點是受樣本量限制和倫理道德因素的制約，難以實現(xiàn)大規(guī)模測試，而且只能對已知安全的產(chǎn)品進行測試，不能用于大規(guī)模的新物質(zhì)篩選。

3.3 細(xì)胞測試和方法

3.3.1 細(xì)胞測試系統(tǒng)

基于細(xì)胞的抗氧化檢測方法可選用皮膚相關(guān)細(xì)胞或血細(xì)胞，前者包括永生化的角質(zhì)細(xì)胞(如HaCaT細(xì)胞)、小鼠成纖維細(xì)胞(L929，3T3)，也可以采用人原代皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞。個人護理產(chǎn)品的功效評價最好選取來源于人的試驗系統(tǒng)為測試對象。有研究采用UVB誘導(dǎo)的角質(zhì)細(xì)胞氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)了米糠中富含抗氧化物質(zhì)［9］。有人用永生化的HaCaT細(xì)胞研究石榴提取物，證明其具有抑制UVB誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和光老化的作用［10］。Gruber等［11］用人原代成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞研究了多種皮膚抗氧化劑的細(xì)胞毒性和作用細(xì)胞24 h后基因組的變化，發(fā)現(xiàn)所有抗氧化劑均引起兩種細(xì)胞上調(diào)的基因是 ACLY、AQP3、COX1、NOS3和PLOD3，兩種細(xì)胞均出現(xiàn)下調(diào)的基因只有 PGR，為開發(fā)新的抗氧化損傷生物標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。

來源于外周血的紅細(xì)胞和白細(xì)胞也可用于抗氧化檢測。紅細(xì)胞不僅是體內(nèi)輸送氧的載體，還對維持白細(xì)胞活性和正常狀態(tài)起作用。在抗氧化方面，紅細(xì)胞保護血管壁微管結(jié)構(gòu)、組織和血管內(nèi)的其他細(xì)胞免受氧化損傷。利用紅細(xì)胞的抗氧化功能可檢測未知物的抗氧化效果。但血細(xì)胞檢測抗氧化的方法多用于保健食品抗氧化功效的評估，反應(yīng)的是全身抗氧化效果，與應(yīng)用于皮膚局部的化妝品相關(guān)程度不高［12］。

3.3.2 細(xì)胞檢測指標(biāo)

不同于動物模型，基于細(xì)胞模式的生物學(xué)評價可以根據(jù)研究需要設(shè)計不同的方案，從而實現(xiàn)復(fù)雜機制的研究和篩選更敏感的生物標(biāo)記物。如研究低劑量長期UVA照射細(xì)胞的氧化損傷作用，可動態(tài)監(jiān)測培養(yǎng)液的細(xì)胞損傷指標(biāo);研究急性UV暴露或化學(xué)物氧化損傷后抗氧化劑對細(xì)胞的恢復(fù)作用，可設(shè)計后孵育步驟;研究低劑量抗氧化劑的細(xì)胞保護作用，可通過基因微陳列技術(shù)篩選多種細(xì)胞的共同生物標(biāo)志物［11］。

皮膚氧化損傷是皮膚相關(guān)細(xì)胞多通路共同參與的復(fù)雜過程和結(jié)果，有的指標(biāo)是氧化損傷的底物(如谷胱甘肽)，而另一些是損傷的中間產(chǎn)物(4-羥基壬烯酸);有的指標(biāo)在早期出現(xiàn)，如蛋白質(zhì)氧化和DNA的損傷(8-二氫-2'-脫氧鳥苷和增殖細(xì)胞核抗原表達(dá))，有的后期發(fā)生(凋亡);有的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定易于檢測，而有的出現(xiàn)短暫難以定量。更多的關(guān)鍵分子可能還不為人所知。因此細(xì)胞模型的抗氧化測試指標(biāo)必然是隨著機制的認(rèn)識深入而不斷改進，也隨著檢測技術(shù)的發(fā)展而不斷進步，例如，最直觀的氧化損傷結(jié)果是細(xì)胞凋亡或壞死，傳統(tǒng)的MTT法無法分辨，采用流式細(xì)胞術(shù)可很好區(qū)分細(xì)胞兩種不同的死亡狀態(tài)。

ROS是導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷的直接原因，測量細(xì)胞內(nèi)ROS的數(shù)量是最直接的抗氧化功效檢測指標(biāo)。而用無細(xì)胞的化學(xué)測試系統(tǒng)無法解釋活體細(xì)胞ROS產(chǎn)生和清除的復(fù)雜機制。為了研究多種植物甾醇阿魏酸酯類物質(zhì)的抗氧化活性和清除自由基的機制，Md Islam 等［13］先用低劑量的10 μM 測試物預(yù)處理3T3成纖維細(xì)胞過夜，再用100 μM的 H2O2處理細(xì)胞2h誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，然后用DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS自由基。結(jié)果表明環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯(CAF)和阿魏酸乙酯能顯著降低ROS水平，并通過抑制NF-κB活性進而降低前炎癥因子的產(chǎn)生而起到抗炎的效果。這是利用細(xì)胞系統(tǒng)闡明同一類植物活性抗氧化物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與活性之間關(guān)系的典型文獻。

傳統(tǒng)檢測細(xì)胞膜的氧化損傷水平，通常采用直接測定脂質(zhì)過氧化酶，或測定谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶間接反應(yīng)，現(xiàn)在很多研究已改用檢測脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的4-羥基壬烯酸水平，后者更為敏感。總之，使用某一終點的測試不足以衡量抗氧化的機制和效果，建立多個檢測終點并行和動態(tài)的試驗組合可以有效和全面評價抗氧化劑的活性。

3.4 皮膚模型系統(tǒng)和方法

皮膚模型系統(tǒng)可以分為離體動物皮膚和體外重建人體皮膚三維模型兩大類，后者最初用于皮膚刺激/腐蝕性、皮膚吸收和光毒性的檢測和研究，基于表皮模型的皮膚刺激試驗替代方法已成為國際標(biāo)準(zhǔn)廣泛使用。近年來，這些模型也逐漸應(yīng)用到化妝品皮膚功能改善的檢測和研究中。

3.4.1 離體皮膚模型

日本學(xué)者［14］將5周齡的 SKH-hrl雌性無毛小鼠背部皮膚取下，平鋪于無菌尼龍網(wǎng)上離體培養(yǎng)，隨后進行UV照射處理，藥物添加方法與細(xì)胞培養(yǎng)方法一致，均是添加于培養(yǎng)基中，其后進行指標(biāo)的測量和分析，包括病理切片、DNA、蛋白組學(xué)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物、細(xì)胞增殖損傷分析等。這些指標(biāo)廣泛而多樣，大大提高了動物的利用效率，可以視為動物實驗的優(yōu)化方法。

3.4.2 Episkin模型

Episkin皮膚模型是歐萊雅公司研發(fā)的體外重建模型，除了用于皮膚刺激的法規(guī)檢測外，有學(xué)者用該模型研究皮膚暴露于臭氧引起氧化應(yīng)激的劑量關(guān)系，用于研究抗氧化劑的防護作用。還用于化妝品配方工藝的研究中，如微乳包囊技術(shù)是近年來化妝品工業(yè)廣泛使用的新工藝，采用這種技術(shù)可使具有相同功效但極性不同的多種抗氧化劑組合在一起(例如親脂性的VE和親水性的VC)制成微乳，用皮膚模型可反復(fù)進行工藝的嘗試，保證用于人體時保持熱力學(xué)穩(wěn)定，提高了產(chǎn)品整體抗氧化功效［15］。還原型和氧化型谷胱甘肽的水平是反應(yīng)皮膚氧化狀態(tài)非常敏感的指標(biāo)，用皮膚模型可以動態(tài)測定不同UVB照射后，皮膚細(xì)胞谷胱甘肽的水平，研究試用產(chǎn)品后氧化還原穩(wěn)態(tài)的影響過程，對于產(chǎn)品開發(fā)非常有用［16］。

3.4.3 EpiDermTM模型

EpiDerm皮膚是美國MatTeck公司開發(fā)的商品化皮膚模型。FT-200是全層皮膚模型，表皮層由基底層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層組成，與體內(nèi)結(jié)構(gòu)非常相似，真皮層為含有成纖維細(xì)胞的膠原基質(zhì)，是進行體外研究的有用模型。該皮膚模型可用于植物來源的抗氧化劑的篩查研究。例如化學(xué)檢測表明石榴含有花色素和水解單寧等強抗氧化活性成份，為證明石榴不同部位提取物的光化學(xué)保護作用。Afaq等用EpiDerm FT-200全層皮膚模型為測試系統(tǒng)，先用抗氧化劑處理1 h，再用 UVB照射(60 mJ/cm2)，后孵育12 h，檢測DNA損傷和蛋白質(zhì)氧化指標(biāo)，如環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)、蛋白質(zhì)氧化和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)。此外，該皮膚模型具有類似于皮膚的活性，UVB照射后可表達(dá)膠原酶(MMP-1)、明膠酶(MMP-2，MMP-9)，基質(zhì)溶解素(MMP-3)、marilysin(MMP-7)、彈性蛋白酶(MMP-12)和彈性蛋白原，用明膠酶譜分析技術(shù)可研究植物抗氧化劑引起 MMP變化的情況［17］。EpiDerm模型也可用于配方的優(yōu)化，如檢測含保濕劑的抗氧化配方的總的抗氧化能力(TAC)是否比不含保濕劑的配方高［18］，檢測指標(biāo)是體外孵育24 h后檢測培養(yǎng)基和組織中TAC和谷胱甘肽過氧化物酶活性。

3.4.4 Phenion皮膚模型

Phenion是德國漢高公司生產(chǎn)的一種商用皮膚模型，全層皮膚模型含有表皮層和真皮層，可以研究紫外線對真皮層膠原蛋白、彈性蛋白、非特異性膠原蛋白酶、核心蛋白多糖等成分的影響。已知UVA照射能引起多種皮膚損傷效應(yīng)，短期作用包括形成ROS、炎癥、光氧化、急性曬黑和持續(xù)曬黑、DNA損傷等，長期作用導(dǎo)致彈性組織變性和光老化，而ROS形成是許多毒性作用通路的共同起點。盡管真皮和成纖維細(xì)胞和UVA照射的最終靶點，但是表皮作為UVA誘導(dǎo)的抗ROS氧化作用的第一道防線也參與并起到關(guān)鍵的作用。UVA的長期作用主要是真皮層的老化，而動物與人相關(guān)性差異太大，志愿者受倫理的約束不可能長期暴露于UVA下進行研究。因此，體外重建模型成為首選的方法。Meloni等［2］使用 PhenionR FT全層皮膚模型進行單次和反復(fù)UVA暴露的生物學(xué)反應(yīng)的研究。

皮膚模型的優(yōu)點在于可根據(jù)研究目的選擇不同結(jié)構(gòu)的模型，如研究 UVB的損傷可選擇表皮模型，研究UVA的損傷可選擇全層皮膚模型;皮膚模型還可模擬生態(tài)環(huán)境研究低劑量長期的紫外線或環(huán)境化學(xué)物的暴露，以及研究復(fù)雜的多種氧化因素的混合作用;還可以進行不同抗氧化配方之間的比較，而上述測試臨床研究和動物模型均不易實現(xiàn)。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，皮膚模型的穩(wěn)定性和仿真性會不斷提高，今后將廣泛用于抗氧化機制研究和產(chǎn)品開發(fā)過程。

總之，盡管目前氧化應(yīng)激機制尚不完全明了，但隨著氧化應(yīng)激分子調(diào)控機制研究的不斷深入，不僅為抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供了新的思路，也為建立有效科學(xué)的檢測評價方法提供了新的理論依據(jù)。通?；趧游锬Ｐ偷钠つw抗氧化功效評價適用于單劑量UV照射和急性化學(xué)試劑局部皮膚暴露，適用于氧化損傷全身效應(yīng)的研究。化學(xué)方法雖然簡單快速，但與生物體內(nèi)效果相去甚遠(yuǎn)。而基于體外細(xì)胞或器官水平的測試可克服動物試驗的缺點，而且比較靈敏，試驗周期短，可實現(xiàn)高通量，適用于大量樣品的抗氧化活性篩查，而且可以提供產(chǎn)品安全性的數(shù)據(jù)，其結(jié)果可直接作為臨床試驗的依據(jù)。特別是近年來，在減少、優(yōu)化和替代動物實驗的3R原則下，使用非動物實驗方法進行化妝品功效研究將成為必然的選擇。

［1］Blumberg J.Use of Biomarkers of Oxidative Stress in Research Studies［J］.J Nutr，2004，134(11):3188-3189.

［2］Meloni M，F(xiàn)arina A，Barbara de Servi.Molecular modifications of dermal and epidermal biomarkers following UVA exposure on reconstructed full-thickness human skin［J］.Photochemical ＆Photobiological Sciences.2010，4:439-447.

［3］Knasmiller S，Nersesyan A，Misik M.Use of convertional andomics based methods for health claims of dietary antioxidants:a critical overview［J］.British Journal of Nutrition.2008，99.ES3-ES52.

［4］Burton GJ，Jauniaux E.Oxidative stress［J］.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol.2011，6:287-299.

［5］McVean M，LieblerDC.InhibitionofUVB induceDNA photodamage in mouse epidermis by topically applied αtocopherol［J］.Carcinogenesis，1997，18(8):1617-1622.

［6］朱彥君，馮光珍，孟宇宏，等.皮膚光老化動物模型的建立.中國體視學(xué)與圖像分析［J］.2004，9(1):51-54.

［7］Gruber JV，Holtz R.Examining the Genomic Influence of Skin Antioxidants In Vitro［J］，Mediators of Inflammation，2010，1-10.

［8］Yoshioka A，Miyachi Y，Imamura S.Mechanisms of reactive oxygen species-induced skin eryhema and superoxide dismutase activities in guinea pig［J］.J Dermatol，1987，14:569-575

［9］Guttman A.Antioxidants enhance efficacy of sunscreening agents［J］.J Int.Derm.，2000，42(12):966-927.

［10］Santa-Maria C E，Miramontes E.Protection against free radicals(UVB irradiation)of a water solube enzymatic extract from rice bran.Study using human keratinocyte monlayer and reconstructed human epidermis［J］.Food and Chemical Toxicology.2010，48:83-88.

［11］Zaid MA，Afaq F，Syed DN，et al.Inhibition of UVB-mediated oxidative stress and markers of photoaging in immortalized HaCaT keratinocytes by pomegranate polyphenol extract POMx［J］.Photochem Photobiol，2007，83:882-888.

［12］Honzel D，Carter SG，Redman KA，et al.Comparison of Chemical and Cell-Based Antioxidant Methods for Evaluation of Foods and Natural Products:Generating Multifaceted Data by Parallel Testing Using Erythrocytes and Polymorphonuclear Cells［J］.J Agric Food Chem.2008，56，8319-8325.

［13］Islam MS，Yoshida H，Matsuki N，et al.Antioxidant，F(xiàn)ree Radical-Scavenging， and NF-κB-Inhibitory Activities of Phytosteryl Ferulates: Structure-Activity Studies［J］. J Pharmacol Sci，2009，111，328-337.

［14］Nakayama S，Katoh EM，Tsuzukj T.Protective effect of αtocopherol-6-O-Phosphate against ultraviolet B induced damage in cultured mouse skin［J］. The Journalofinvestigative dermatology，2003.8.121(2):406-411.

［15］Branka R，Mirjana G，Estelle TT，et al.Simultaneous absorption ofvitamins C and E from topicalmicroemulsions using reconstructed human epidermis as a skin model［J］.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2009，72:69-75.

［16］Meloni M，Nicolay J F.Dynamic monitoring of glutathione redox status in UV-B irradiated reconstituted epidermis: effectof antioxidant activity on skin homeostasis［J］.Toxicol In Vitro，2003，17(5-6):609-613.

［17］Afaq F，Zaid M，Khan N，et al.Protective effect of pomegranate derived products on UVBmediated damage in human reconstituted skin［J］.Exp Dermatol.2009，18(6):553-561.

［18］Grazul-Bilska AT，Bilski JJ，Redumer DA.Antioxidant capacity of 3Dhuman skin EpidermTMmodel:effects of skin moisturizers［J］.Int.Jour.of Cosmetic Science，2009，31，201-208.