蜜蜂（Apis mellifera）美洲幼蟲腐臭病最新研究進展

陳 傲 孫 杰 繆曉青

（福建農(nóng)林大學蜂學學院，福州 350002）

蜜蜂中最常見的細菌病為美洲幼蟲腐臭?。ˋmerican foulbrood，AFB）和歐洲幼蟲腐臭?。‥uropean foulbrood，EFB）。近兩年來發(fā)表的文獻中對美洲幼蟲腐臭病的研究較多，該病于1907年確定，目前廣泛發(fā)生于溫帶與亞熱帶地區(qū)的幾乎所有國家，給這些國家的養(yǎng)蜂業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。被感染的蜜蜂幼蟲在孵化后12.5天出現(xiàn)癥狀，首先體色明顯變化，從正常的珍珠白變黃、淡褐色、褐色甚至黑褐色，同時蟲體不斷失水，最后干癟并緊貼于巢房壁，呈黑褐色難以清除的鱗片狀物。感染美洲幼蟲腐臭病的蜂群如果沒有得到適當?shù)闹委?，會導致整個蜂群的死亡。為了控制美洲幼蟲腐臭病的發(fā)生，養(yǎng)蜂生產(chǎn)中使用各種化學藥物對蜂群進行處理，但是已經(jīng)有很多國家報道美洲幼蟲腐臭病對一些化學藥物產(chǎn)生了抵抗。濫用藥物還會引起蜂產(chǎn)品污染，因此，這些化學藥物的使用應該受到限制。研究美幼病的流行病學特征和防治新技術(shù)對于減少和控制病害的發(fā)生以及在環(huán)境保護方面具有重要意義。

1 病原

美洲幼蟲腐臭病的病原體為擬幼蟲芽孢桿菌原（Paenibacillus Larvae），是一種芽孢形式的革蘭氏陽性細菌。產(chǎn)生的芽孢有7層結(jié)構(gòu)包圍，這種特殊構(gòu)造使得幼蟲芽孢桿菌的芽孢具有特別強的生命力，對熱、化學物質(zhì)等有極強的抵抗力，在高溫干燥等惡劣環(huán)境下至少能存活35年。目前已知幼蟲芽孢桿菌的基因型至少有5種，且不同基因型的細菌株系所導致的美洲幼蟲腐臭病的流行情況略有不同。Di Pinto， Angela等（2011）對普利亞（意大利）蜂蜜和子脾中的擬幼蟲芽孢桿菌的的發(fā)生和分布進行了調(diào)查。通過ERIC-PCR對擬幼蟲芽孢桿菌的基因分型進行研究，產(chǎn)生了四種不同的ERIC帶型（ERIC-A，ERIC-B，ERIC-C，ERIC-D），包括200-3000 bp范圍內(nèi)的片段。基因型會影響擬幼蟲芽孢桿菌的感染，蜂群或蜂場的多基因型通過影響臨床癥狀發(fā)展的類型和速度可能會增加擬幼蟲芽孢桿菌感染的復雜性。不同基因型的幼蟲芽孢桿菌可以通過PCR技術(shù)和16SrRNA的編碼基因的限制性酶切片段多態(tài)性加以區(qū)別鑒定。

Douglas W. Dingman（2012）對從134株擬幼蟲芽孢桿菌菌株中提取的基因組DNA擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)16S–23S rDNA基因間存在三個基因間隔（ITS）區(qū)域，意味著擬幼蟲芽孢桿菌中至少有三種類型的rrn操縱子，23S rRNA基因通過I-CeuI消化顯示，基因組DNA的脈沖場凝膠電泳具有7個拷貝，這顯示擬幼蟲芽孢桿菌基因組具有7個rrn操縱子拷貝。對擬幼蟲芽孢桿菌的16S–23S rDNA的ITS區(qū)域的研究可以輔助病原的診斷。

2 流行病學特征

美洲幼蟲腐臭病是由幼蟲芽孢桿菌這種特殊的芽孢引起的，而不是它的營養(yǎng)體。幼蟲孵化后48h內(nèi)，即1日齡和2日齡的幼蟲對擬幼蟲芽孢桿菌芽孢非常敏感，不足10個芽孢就可以使蜜蜂幼蟲發(fā)病，并殺死幼蟲，但是侵染2日齡以上的幼蟲，則需要數(shù)以百計的芽孢。早期報道稱擬幼蟲芽孢桿菌的孢子在蜜蜂幼蟲中腸內(nèi)萌發(fā)，并通過吞噬作用進入上皮細胞后快速繁殖，最后殺死幼蟲。但是，最近有報道稱，擬幼蟲芽孢桿菌是通過細胞旁擴散途徑破壞蜜蜂幼蟲中腸上皮壁而進入中腸組織。Karina等（2009）報道，擬幼蟲芽孢桿菌主要致病因子是一些胞外分泌的蛋白酶（PP1、PP2），研究表明，這些蛋白酶為含鋅的金屬蛋白酶，屬典型的多聚蛋白酶。幼蟲芽孢桿菌在蜜蜂群內(nèi)以水平傳播和垂直傳播兩種方式進行傳播，而在群間的傳播則主要是通過垂直傳播。擬幼蟲芽孢桿菌的這種傳播方式使得它成為蜜蜂一種傳染性極強的疾病。由于芽孢只要在適宜的環(huán)境下就能萌發(fā)，所以美洲幼蟲腐臭病的發(fā)生沒有一定的季節(jié)性，病害能在一年中的任何一個有幼蟲的季節(jié)都有可能發(fā)生，但是一般在夏、秋季節(jié)發(fā)生的相對較多。

3 病原鑒定

對于擬幼蟲芽孢桿菌的鑒定，早些時候一般是通過生化手段或分離培養(yǎng)的方式進行鑒定。由于擬幼蟲芽孢桿菌生長環(huán)境的特殊性，現(xiàn)在主要通過PCR技術(shù)對其進行鑒定。Dobbelaere W 等（2001）發(fā)展了一種以16SrRNA編碼基因片段為引物的PCR技術(shù)來鑒定幼蟲芽孢桿菌的方法，實驗證明該方法快速、可靠，在4小時內(nèi)就能做出正確的診斷。Alippi等（2004）設(shè)計的1對引物KAT1和KAT2的特異性非常強，可以鑒別出擬幼蟲芽孢桿菌的不同亞種。經(jīng)過不斷的完善和改進，目前PCR技術(shù)可以在蜜蜂幼蟲尚未發(fā)病時檢測出低濃度的芽孢，使得PCR成為目前研究美洲幼蟲腐臭病的最佳選擇。

4 防治

由于美洲幼蟲腐臭病的危害極大，因此如何防治的問題一直受到人們的高度重視，其中抗生素為使用最多、應用最廣的藥物。自1944年以來，硫胺噻唑、土霉素、林可霉素、泰樂菌素、磺胺類、紅霉素等抗生素相繼被用于美洲幼蟲腐臭病的治療中。然而，抗生素會在蜂產(chǎn)品中殘留，影響蜂產(chǎn)品的質(zhì)量，給人類的健康造成威脅。除此之外，抗生素還會使蜜蜂的抗藥性增強，導致病原體產(chǎn)生變異，使得蜂群患病更加嚴重。因此，尋找其他更好的藥物和途徑來治療美洲幼蟲腐臭病顯得非常必要。Katarina等（2001）報道從蜂王漿中分離出的一個多肽片段可以做為抑制美洲幼蟲腐臭病的潛在因子。2002年，Bachanova K等通過多聚酰胺凝膠上細菌生長抑制試驗證實了蜂王漿中的抗菌肽抑制幼蟲芽孢桿菌生長的活性。Gallardo GL等（2004年）報道從蜂房花粉中分離出的兩個真菌株系L一細交鏈孢菌酮酸（L-Tenuazonic acid）對幼蟲芽孢桿菌的生長具有特殊的抑制能力。Aronstein A等（2004）報道蒜素（Allicin）能在一定程度上抑制幼蟲芽孢桿菌生長，從而減少美洲幼蟲腐臭病的發(fā)生。李位三等（2008）報道從半枝蓮、大黃、黃柏等中草藥提取有效成分，配制成的“蜂幼康”顆粒劑對美洲幼蟲腐臭病等細菌病有很好的防治作用。

2012年3月，美國食品藥物管理局（FDA）批準通過了LINCOMIX可溶性粉作為治療美洲幼蟲腐臭的新藥物，由美國農(nóng)業(yè)部的蜜蜂研究實驗室與NRSP-7進行合作對該藥物進行研究，為該藥物的批準提供支持，證明LINCOMIX可溶性粉在控制蜜蜂AFD時是安全和有效的。Benitez等（2012）報道幼蟲芽孢桿菌LBM5006產(chǎn)生的一種抗菌因子可以有效地抑制擬幼蟲芽孢桿菌，質(zhì)譜分析表明，抗菌活性與伊枯草菌素肽類有關(guān)。Mikio Yoshiyama等（2012）從發(fā)酵物料和食物中分離出乳酸菌（LAB）研究其在活體外對擬幼蟲芽孢桿菌的抑制作用，結(jié)果表明，有9種菌株抑制了擬幼蟲芽孢桿菌的體外生長。通過實時RT-PCR對菌株進行篩選，將篩選出的LAB對幼蟲和成蜂進行口服給藥后，發(fā)現(xiàn)抗菌肽基因如abaecin， defensin和hymenoptaecin的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。Mikio Yoshiyama等（2012）研究發(fā)現(xiàn)蜂膠乙醇提取物能顯著抑制擬幼蟲芽孢桿菌在體外生長，抑菌強度不僅與蜂膠中化合物的含量有關(guān)，與黃酮類化合的之間顯著的交互影響作用也有一定的關(guān)系。Sabate，D C等（2012）研究表明甘菊花中的揮發(fā)油、己烷（HE）、和苯提取物可以抑制擬幼蟲芽孢桿菌，HE表現(xiàn)出最高的抗擬幼蟲芽孢桿菌的活性。由枯草芽孢桿菌C4和甘菊花中的HE合成的具有生物表面活性劑的表面活性素在抑制擬幼蟲芽孢桿菌方面具有協(xié)同作用。

5 討論

（1）通過PCR技術(shù)可以對擬幼蟲芽孢桿菌進行快速、準確的診斷，但是在不同地區(qū)，擬幼蟲芽孢桿菌存在很多不同的基因型，不同基因型的擬幼蟲芽孢桿菌引起的蜂群患病情況可能有所不同，有必要通過PCR技術(shù)及DNA測序技術(shù)對擬幼蟲芽孢桿菌進行基因序列分析，并繪制其基因圖譜。

（2）雖然很多國家已經(jīng)出臺了相關(guān)法規(guī)限制抗生素的使用，但是蜂產(chǎn)品中抗生素超標的問題還是屢見不鮮。越來越多的研究者加入到探索對環(huán)境危害小、對人畜安全的新藥物的行列中，也發(fā)現(xiàn)了一些能抑制擬幼蟲芽孢桿菌生長的制劑和活性因子，如蜂膠乙醇提取物、乳酸菌、枯草芽孢桿菌C4和甘菊花提取物中的表面活性素等等，實驗證明它們確實能對擬幼蟲芽孢桿菌的活性產(chǎn)生抑制，但是具體是哪些活性成分在起作用，各活性成分與抑菌效果的關(guān)系，以及抑制機制等問題還有待進一步研究。

（3）如何將那些安全高效的蜂用抗菌藥物使用到大規(guī)模養(yǎng)蜂生產(chǎn)中，以及藥物的用法、用量、用藥周期等問題還有待進一步的實踐驗證。

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