鐵皮石斛與鐵皮石斛原球莖質(zhì)量比較的研究進(jìn)展

韋麗文辛 寧李培泰時(shí)顯蕓*

（1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2 廣西生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 柳州 545004）

鐵皮石斛與鐵皮石斛原球莖質(zhì)量比較的研究進(jìn)展

韋麗文1辛 寧1李培泰2時(shí)顯蕓1*

（1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2 廣西生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 柳州 545004）

鐵皮石斛是一種名貴中藥材，其藥理作用廣泛，得到了廣泛應(yīng)用，但其自然繁殖率低，資源形勢較為嚴(yán)峻。近年來，研究者們多集中于對(duì)鐵皮石斛的胚性組織原球莖進(jìn)行研究，本文通過對(duì)比研究鐵皮石斛與鐵皮石斛原球莖在化學(xué)成分、藥理作用、石斛多糖成分的提取及測定方法上的差別，以探討鐵皮石斛原球莖成為鐵皮石斛新藥材資源的可能性。

鐵皮石斛；鐵皮石斛原球莖；質(zhì)量比較

鐵皮石斛藥材為蘭科屬植物鐵皮石斛的干燥莖，具有益胃生津，滋陰清熱等功效，用于熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目暗不明，筋骨萎軟等病癥。因其種子極小、無胚乳、自然繁殖率極低[1]，被列為國家二級(jí)保護(hù)植物，而人們不斷地開發(fā)使用，使得鐵皮石斛資源迅速減少，因此，如何持續(xù)利用鐵皮石斛藥材，或開發(fā)鐵皮石斛的藥材新資源，成為近年來眾多研究者們的新課題。鐵皮石斛原球莖是由鐵皮石斛種子通過無菌培養(yǎng)誘導(dǎo)繁殖形成的[2]。它是種子萌發(fā)過程中，原胚萌動(dòng)膨大，突破種皮后形成的淺黃色小圓錐形胚性組織[3]。以鐵皮石斛原球莖為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過改變培養(yǎng)基條件，可使鐵皮石斛原球莖生長旺盛，繁殖率高，具有較好的開發(fā)前景[4]。本文對(duì)鐵皮石斛與鐵皮石斛原球莖化學(xué)成分、藥理作用、石斛多糖提取及測定方法進(jìn)行對(duì)比研究，探討鐵皮石斛原球莖作為鐵皮石斛新藥源的可能性。

1 化學(xué)成分

1.1 鐵皮石斛的化學(xué)組成

鐵皮石斛的化學(xué)組成主要有石斛多糖、生物堿、氨基酸、菲類化合物以及金屬元素等。石斛多糖為鐵皮石斛的最主要成分，是其發(fā)揮藥理作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。吳剛等[5]通過對(duì)19種石斛的多糖及生物堿含量進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛的多糖含量為19.26%，總生物堿含量為0.359%。蔣秀梅等[6]檢測出鐵皮石斛鮮品含有6種人體必需氨基酸，1種半必需氨基酸，其中谷氨酸和天門冬氨酸的含量最高。黎萬奎等[7]通過實(shí)驗(yàn)比較了人工栽培鐵皮石斛與其他來源鐵皮石斛中氨基酸含量得出人工栽培鐵皮石斛與其他不同來源鐵皮石斛材料中各種氨基酸組成及含量一致，以天冬氨酸含量最高，其次為谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、丙氨酸等。李榕生等[8]運(yùn)用各種柱色譜方法進(jìn)行化學(xué)成分分離提純，從而得到六種化合物，分別鑒定為2，3，4，7-四甲氧基菲、1，5-二羧基-1，2，3，4-四甲氧基菲、2，5-二羥基-3，4-二甲氧基菲、2，7-二羧基-3，4，8-三甲氧基菲、2，5-二羧基-3，4-二甲氧基菲、3，5-二羧基-2，4-二甲氧基菲。其中化合物1，5-二羧基-1，2，3，4-四甲氧基菲、2，5-二羥基-3，4-二甲氧基菲、3，5-二羧基-2，4-二甲氧基菲為首次從石斛屬植物中分離得到。諸燕等[9]采用電感耦合等離子質(zhì)譜法、原子吸收光譜法對(duì)11個(gè)種質(zhì)32個(gè)樣品的鐵皮石斛的金屬元素進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛中鉀、鈣、鎂、錳、鋅、鉻、銅平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1205.23，766.82，158.25，31.06，4.28，8.28，0.97mg/kg，砷、汞、鉛、鎘4種重金屬元素含量除1個(gè)樣品鎘元素超過限量指標(biāo)0·07mg/kg外，均在規(guī)定限度范圍內(nèi)，種質(zhì)與生理年齡對(duì)金屬元素的積累影響顯著。

1.2 鐵皮石斛原球莖的化學(xué)成分

鐵皮石斛原球莖是由鐵皮石斛組織分化形成，具有與鐵皮石斛藥材相似的化學(xué)組成，但在各成分的含量以及單一成分的組成上仍有一定差別，而鐵皮石斛原球莖可通過改變不同培養(yǎng)條件使其中有效成分含量得以提高。在這一問題上陳曉梅等人進(jìn)行了較為深入的研究，其運(yùn)用高效液相-質(zhì)譜分析法對(duì)真菌誘導(dǎo)子處理的鐵皮石斛原球莖和對(duì)照原球莖以及鐵皮石斛的指紋圖譜進(jìn)行研究分析得出經(jīng)誘導(dǎo)子處理的鐵皮石斛原球莖沒有改變?cè)蚯o的化學(xué)背景，和鐵皮石斛的化學(xué)成分相似，而真菌誘導(dǎo)子能促進(jìn)原球莖中生物堿類成分的產(chǎn)生和特異性積累，石斛多糖是鐵皮石斛及其原球莖的共有成分，但在單糖的組成上有所差異[10]。在培養(yǎng)原球莖過程中加入MF24液體發(fā)酵菌絲制備的誘導(dǎo)子可提高原球莖的多糖含量[2]。其用相同的提取方法對(duì)鐵皮石斛藥材及其原球莖的多糖成分進(jìn)行提取，石斛粗多糖主要由Man和Glu組成，而原球莖粗多糖主要由Gal、Ara 和Glu組成[11]。何鐵光等[12]通過實(shí)驗(yàn)分析得出鐵皮石斛野生品及其懸浮培養(yǎng)的原球莖都含有17種氨基酸，前者以谷氨酸、天冬氨酸、纈氨酸和亮氨酸為主要氨基酸，后者以懸浮培養(yǎng)的谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸為主要氨基酸，在人體必需氨基酸中，兩者都含有除色氨酸以外的全部人體必需氨基酸，其中，亮氨酸比例最高。孟志霞等[3]從鐵皮石斛原球莖中得到8個(gè)化合物，分別1-O-p-阿魏?；?β-D-吡喃葡萄糖苷（Ⅰ），arillatoseB（Ⅱ），4-（β-D-吡喃葡萄糖基）芐醇（Ⅲ），4-羥甲基-2，6-二甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（Ⅳ），三十六烷酸（Ⅴ），二十七烷醇（Ⅵ），β-谷甾醇（Ⅶ），3β，25-二羥基-23-烯-環(huán)菠蘿蜜烷（Ⅷ），其中化合物1、2、3、4、8為首次從石斛屬中分得。

2 藥理作用

2.1 鐵皮石斛的藥理作用

鐵皮石斛中含有的多糖、生物堿、氨基酸等化學(xué)成分是其藥理作用發(fā)揮的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，鐵皮石斛具有提高人體免疫力、抗氧化以及抗腫瘤等方面的作用，隨著研究的不斷深入，一些新的藥理作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。趙水靈等[13]對(duì)石斛多糖進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其能使小鼠的胸腺、脾等部位的重量增加、抗體細(xì)胞數(shù)明顯增多，從而使免疫作用得以增強(qiáng)。鮑素華等[14]通過對(duì)鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性研究，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖隨著濃度的增大其抗氧化的活性也逐漸增強(qiáng)。鮑麗娟[15]對(duì)四種石斛的抑瘤作用進(jìn)行了研究，其中鐵皮石斛提取物中的乙酸乙酯部位對(duì)人宮頸癌HelaS3的抑制作用相對(duì)于石油醚部位、正丁醇部位以及水提物的效果要好，而石油醚部位對(duì)于肝癌HepG2的抑制較好，但四個(gè)部位的抑瘤作用差別不大。

2.2 鐵皮石斛原球莖的藥理作用

相似的化學(xué)組成，致使鐵皮石斛原球莖與鐵皮石斛有著相似的藥理作用。何鐵光等[16]鐵皮石斛原球莖進(jìn)行研究表明其多糖含量與野生鐵皮石斛的相當(dāng)，且能通過提高機(jī)體免疫功能和抗氧化能力抑制腫瘤的生長。高建平等[17]比較了鐵皮石斛原球莖與原藥材的免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)現(xiàn)，原球莖能提高機(jī)體非特異性免疫功能和細(xì)胞免疫功能，并與原藥材相比作用強(qiáng)度相似。何鐵光等[18]對(duì)鐵皮石斛原球莖中多糖DCPP1a-1抗腫瘤活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)三個(gè)不同劑量的多糖DCPP1a-1對(duì)小鼠肝癌H22有不同的抑制效果，其中低劑量組（50mg/k）相對(duì)于中劑量組（150mg/kg）及高劑量組（250mg/kg）的抑制作用更為顯著，與腫瘤對(duì)照相比，多糖低劑量組小鼠的胸腺和脾指數(shù)顯著增加了，增強(qiáng)了小鼠的機(jī)體免疫力。此研究組還對(duì)鐵皮石斛原球莖多糖DCPP1a-1對(duì)氧自由基和脂質(zhì)過氧化的影響進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鐵皮石斛原球莖多糖DCPP1a-1具有較強(qiáng)的抗氧化活性。林宏等[19]利用細(xì)胞溶血法測定鐵皮石斛原球莖中均一多糖D-02C的CH50值，并與肝素鈉的CH50值進(jìn)行對(duì)比研究對(duì)比表明D-02C具有較弱的補(bǔ)體活性。

3 石斛多糖的提取及含量測定

3.1 鐵皮石斛及鐵皮石斛原球莖中多糖成分的提取

石斛多糖是鐵皮石斛發(fā)揮其藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是其含量較多的一類成分，那么如何高效提取石斛多糖，成為眾多學(xué)者的課題，鐵皮石斛藥材中多糖成分的提取方法經(jīng)歷了由傳統(tǒng)的水提醇沉法到超聲提取、酶提取的發(fā)展，使得石斛多糖的提取效率得到大大地提高。錢葉等[20]對(duì)粉碎度、提取次數(shù)、加水量及提取時(shí)間等因素對(duì)石斛多糖提取的影響大小進(jìn)行了正交試驗(yàn)，結(jié)果表明影響石斛提取含量的因素依次為粉碎度＞提取次數(shù)＞加水量＞提取時(shí)間。在水提法的基礎(chǔ)上加入超聲提取法，可以使石斛多糖的提取率得到提高，即在將石斛粉過篩后對(duì)其進(jìn)行超聲水浴提取，通過對(duì)比得出當(dāng)超聲功率為300W時(shí)，超聲頻率為45kHz時(shí)多糖得率最高[21]。魏明等[22]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)超聲波功率達(dá)到300W時(shí)多糖提取量為最大值。當(dāng)超聲波功率過大時(shí)，可能因?yàn)槌暡ǖ膭×艺駝?dòng)使多糖降解，從而使得多糖提取量出現(xiàn)了下降的趨勢[23]。尚喜雨[24]對(duì)鐵皮石斛多糖用水提法、酶法進(jìn)行了研究，其中水提法的最佳提取條件為：固液比1∶80，水溫100℃，浸提時(shí)間2h，提取次數(shù)2次；聯(lián)合酶法的最佳提取條件為：酶量（木瓜蛋白酶和纖維素蛋白酶等量混合）4%，水溫為40℃，pH值為6，酶解3h。結(jié)果水提法的多糖平均提取率為12.07%，酶法的多糖平均提取率為20.84%，說明聯(lián)合酶法提取鐵皮石斛多糖優(yōu)于單純水提法。

鐵皮石斛藥材中石斛多糖的提取方法已經(jīng)研究得較為透徹，從目前的研究狀況觀察可知，用于鐵皮石斛原球莖多糖的提取方法為水提法，其提取過程與鐵皮石斛藥材中多糖的水提法過程相似，也有研究者對(duì)此方法的影響因素進(jìn)行了比較優(yōu)選。何鐵光[18]選用熱水浸提，并對(duì)浸提時(shí)間、浸提次數(shù)、溫度及加水量等4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各因素作用大小關(guān)系依次為提取次數(shù)＞加水量＞提取溫度＞浸提時(shí)間，且最佳條件為提取2h，提取次數(shù)為3次，溫度為80℃，加水量20倍，劉靜平等[25]運(yùn)用正交試驗(yàn)優(yōu)選鐵皮石斛類原球莖多糖的提取純化工藝相似結(jié)論。岑忠等[26]對(duì)用熱水浸提鐵皮石斛原球莖多糖的條件進(jìn)行了優(yōu)選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明影響最大的因素是浸提次數(shù)，其次是浸提時(shí)間，料水質(zhì)量比和浸提溫度。且最佳實(shí)驗(yàn)條件為浸提次數(shù)為4次，浸提3h，料水質(zhì)量比為1∶60，近體溫度為80℃，多糖得率達(dá)到9.17%。

4 鐵皮石斛藥材及其原球莖石斛多糖的含量測定

多糖成分對(duì)鐵皮石斛的重要性決定了對(duì)其進(jìn)行含量測定并作為鐵皮石斛的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有著重要的意義，石斛多糖含量測定的方法主要有蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法、DNS（3，5-二硝基水楊酸比色法），有觀點(diǎn)認(rèn)為DNS較優(yōu)于前兩種方法。林雅等[27]采用蒽酮-硫酸法測定石斛中的多糖含量，其依據(jù)多糖在硫酸的作用下先水解成單糖分子，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后利用與蒽酮的顯色反應(yīng)生成橙黃色化合物，最后以比色法測定其吸光值，進(jìn)而計(jì)算出多糖含量。劉宏源等[28]首次采用DNS（3，5-二硝基水楊酸比色法）法測定鐵皮石斛中水溶性多糖的含量，并認(rèn)為該方法具有重復(fù)性好、雜質(zhì)干擾少、快速、準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)。因DNS在偏堿性條件下與多糖水解產(chǎn)物還原糖共熱后被還原生成棕紅色的氨基化合物（3-氨基-5-硝基水楊酸）。該化合物在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈比例關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。林燕飛等[29]利用3，5-二硝基水楊酸比色法，以葡萄糖為對(duì)照測定，研究鐵皮石斛不同采收期和不同生長期水溶性多糖的含量變化規(guī)律，研究者認(rèn)為DNS（3，5-二硝基水楊酸）相比較苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，因鐵皮石斛中的主要藥效成分是水溶性多糖而非單糖，苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法二個(gè)方法僅能測定總水溶性糖，而DNS法可以通過測定還原糖（或單糖）和總糖，從而計(jì)算得到總水溶性多糖。目前，原球莖多糖含量的測定方法則多采用苯酚-硫酸法[30-31]。

5 結(jié) 語

通過對(duì)鐵皮石斛及其原球莖進(jìn)行質(zhì)量對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，兩者的化學(xué)組成、藥理作用都較為相似，均具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤活性，兩者發(fā)揮藥理作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)均為石斛多糖，但在多糖的含量以及組成上兩者有著一定的差別，鐵皮石斛胚性組織原球莖有作為鐵皮石斛新藥材資源的可能性，因此，鐵皮石斛原球莖多糖成分在其生長過程中有著怎樣的變化積累過程，以及怎樣通過改變培養(yǎng)條件來增加其多糖成分，值得深入研究。其次，鐵皮石斛和鐵皮石斛原球莖在多糖的提取及測定方法上較為相似，但相對(duì)于鐵皮石斛多糖較為豐富的提取及測定方法而言，運(yùn)用于提取及測定鐵皮石斛原球莖中石斛多糖的方法卻十分單一，那么，原球莖多糖在提取及含量測定方法上能否運(yùn)用原藥材的優(yōu)選條件仍有探討價(jià)值。

[1] 邵華,張玲琪,李俊梅,等.鐵皮石斛研究進(jìn)展[J].中草藥,2004,35 (1):109-112.

[2] 楊慧,陳曉梅,郭順星.真菌誘導(dǎo)子對(duì)鐵皮石解原球莖多糖含量的影響[J].世界科學(xué)技術(shù),2009,11(5):719-721.

[3] 孟志霞,舒瑩,王春蘭,等.鐵皮石斛原球莖的化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志,2012,47(12):953-955.

[4] 吳剛,季祥彪,康冀川,等.石斛中多糖和生物堿的含量測定[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2008,2(3):274-278.

[5] 宋經(jīng)元,郭順星,肖培根.鐵皮石斛原球莖液體懸浮培養(yǎng)的研究[J].中草藥,2004,9(35):1042-1046.

[6] 蔣秀梅,劉驊,張治國.鐵皮石斛和金釵石斛的氨基酸分析[J].浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),1999,(39):26.

[7] 黎萬奎,胡之壁,周吉燕,等.人工栽培鐵皮石斛與其他來源鐵皮石斛中氨基酸與多糖及微量元素的比較分析[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,22(4):80-83.

[8] 李榕生,楊欣,何平,等.鐵皮石斛根莖中菲類化學(xué)成分分析[J].中藥材,2009,32(2):220-223.

[9] 諸燕,苑鶴,李國棟,等.鐵皮石斛中11種金屬元素含量的研究[J].中國中藥雜志,2011,36(3):356-359.

[10] 陳曉梅,肖盛元,王春蘭,等.真菌誘導(dǎo)子處理的鐵皮石斛原球莖HPLC-MS指紋圖譜分析[J].中國藥學(xué)雜志,2008,43(24):1859-1862.

[11] 陳曉梅,王春蘭,王愛榮,等.鐵皮石斛原球莖多糖的研究[J].中國藥學(xué)雜志,2011,46(20):1552-1556.

[12] 何鐵光,蘇江,王燦琴,等.鐵皮石斛不同來源材料多糖和氨基酸含量的比較[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,38(1):32-34.

[13] 趙永靈,王世林,李曉玉.兜唇石斛多糖的研究[J].云南植物研究, 1994,16(4):392.

[14] 鮑素華,查學(xué)強(qiáng),郝杰,等.不同分子量鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性研究[J].食品科學(xué),2009,30(21):123-127.

[15] 鮑麗娟.四種石斛抗腫瘤活性的研究[D].合肥:合肥工業(yè)大學(xué), 2007.

[16] 何鐵光.鐵皮石解原球莖多糖的誘導(dǎo)、提純、理化性質(zhì)及生物活性研究[D].廣西:廣西大學(xué),2007.

[17] 高建平,金若敏,吳耀平,等.鐵皮石解原球莖與原藥材免疫調(diào)節(jié)作用的比較研究[J].中藥材,2002,25(7):487-489.

[18] 何鐵光,楊麗濤,李楊瑞,等.鐵皮石斛原球莖多糖DCPP1a-1的理化性質(zhì)及抗腫瘤活性[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2007,19:578-583.

[19] 林宏,施松善,王順春,等.鐵皮石斛原球莖多糖D-02C的結(jié)構(gòu)特征及其抗補(bǔ)體活性[J].福建中醫(yī)藥,2012,43(3):54-57.

[20] 葉錢,呂不望.石斛中石斛多糖的提取工藝研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2005,22(4):293-294.

[21] 葉余原.超聲法提取鐵皮石斛多糖工藝的研究[J].中藥材,2009, 32:617-620.

[22] 魏明,邵平,姚紅,等.超聲協(xié)同纖維酶法提取霍山石斛多糖的研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(3):199-201.

[23] 鄭靜,常迺滔,林英,等.超聲波法和超聲波酶法提取靈芝多糖的條件研究[J].食用菌學(xué)報(bào),2006,13(1):48-52.

[24] 尚喜雨.水提法酶法提取鐵皮石斛多糖的比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(18):9787-9788.

[25] 劉靜平,朱先紅,賈景明,等.正交試驗(yàn)優(yōu)選鐵皮石斛類原球莖多糖的提取純化工藝[J].中國藥房,2011,22(15):1378-1379.

[26] 岑忠用,蘇江,梁冠興,等.熱水浸提法提取鐵皮石斛原球莖多糖的工藝[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,50(18):3807-3810.

[27] 林雅,林國青,徐偉,等.石斛多糖的含量測定[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,19(3):27-28.

[28] 劉宏源,楊金燕,黃松,等.3,5-二硝基水楊酸法測定鐵皮石斛中多糖的含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2010,6(8):14-16.

[29] 林燕飛,曾蘇,林小香,等.鐵皮石斛水溶性多糖含量的動(dòng)態(tài)研究采用[J].現(xiàn)代中藥研究與踐,2009,23(2):19-21.

[30] 蘇江,羅興錄,何鐵光,等.鐵皮石斛原球莖固體培養(yǎng)和液體懸浮培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,16(4):161-165.

[31] 何鐵光,楊麗濤,李楊瑞,等.鐵皮石斛原球莖多糖提取最佳工藝研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,15(5):240-243.

R282.71

A

1671-8194（2013）25-0059-03

廣西鐵皮石斛品種資源評(píng)價(jià)及優(yōu)良品種繁育技術(shù)研究（2013CD）

*通訊作者：E-mail:shxy655@126.com