靶向c-FLIP在癌癥治療中的分子調(diào)節(jié)機(jī)制①

王琪琳 (聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，聊城 252059)

凋亡對于維持組織的自穩(wěn)態(tài)和正常發(fā)育非常重要。與凋亡相關(guān)的信號通路主要有兩個:一個是配體結(jié)合誘導(dǎo)的外部凋亡通路，另一個是線粒體依賴的內(nèi)部凋亡通路。c-FLIP是外部凋亡通路中的一個重要負(fù)調(diào)控因子，它的13個剪切突變體基因已經(jīng)被鑒定，但是只有三個能翻譯成蛋白質(zhì)(c-FLIPL、c-FLIPS和c-FLIPR)。c-FLIPL是一個55 kD的蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)類似于Caspase-8前體，氨基端有兩個DED結(jié)構(gòu)域，羧基端有一個Caspase結(jié)構(gòu)域。但由于c-FLIPL的羧基端結(jié)構(gòu)域缺乏半胱氨酸(Cys)，因此缺乏酶的活性。c-FLIPS和c-FLIPR在氨基端也含有兩個DED結(jié)構(gòu)域，但是其羧基末端都比c-FLIPL羧基末端短。在c-FLIPS和c-FLIPR中，兩個DED結(jié)構(gòu)域被一串氨基酸連接，在蛋白質(zhì)的泛素化和降解方面可能具有重要作用［1］。c-FLIP的表達(dá)可以在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，并受磷酸化和泛素化的影響。在許多腫瘤細(xì)胞中，c-FLIP表達(dá)較高，用c-FLIP抑制劑與TRAIL或者與傳統(tǒng)化療聯(lián)合處理，可使c-FLIP表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此c-FLIP在癌癥治療中可作為一個重要的分子靶標(biāo)。

1 c-FLIP

1．1 腫瘤細(xì)胞中c-FLIP的過表達(dá) c-FLIP在一系列癌癥，如結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌中表達(dá)較高。在大多數(shù)情況下，c-FLIPL在惡性腫瘤中表達(dá)增加;另有研究表明c-FLIPS表達(dá)也上調(diào)，如在胃癌SNU-216細(xì)胞和胰腺癌中c-FLIPS表達(dá)上調(diào)［2］。c-FLIP的過表達(dá)可增加拮抗 Fas、TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。研究證實(shí)，在某些組織中c-FLIP的高表達(dá)水平還與腫瘤的遷徙有關(guān)。在結(jié)腸癌、宮頸癌、伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和膀胱癌中，c-FLIP的表達(dá)水平升高與不良預(yù)后有關(guān)［3，4］。c-FLIP 異構(gòu)體在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，其表達(dá)水平不僅與死亡受體靶向的治療有關(guān)，還與傳統(tǒng)治療有關(guān)，因?yàn)閏-FLIP抑制抗癌藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

1．2 c-FLIP的作用 在外部凋亡通路中，c-FLIP募集到DISC中可以抑制Caspase-8前體的二聚化和活性，從而抑制凋亡事件的發(fā)生。c-FLIPL與Caspase-8前體可以形成一個異源二聚體，c-FLIPL與Caspase-8前體的異源二聚化，可以誘導(dǎo)Caspase-8的活性［5］。復(fù)合體中Caspase-8的有限激活可以產(chǎn)生p43-c-FLIP和p41/p43-Caspase-8亞單元，然而由于c-FLIPL缺乏蛋白酶水解活性，進(jìn)一步的切割不能發(fā)生，切割的產(chǎn)物繼續(xù)與DISC結(jié)合，阻止凋亡信號的進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)。盡管如此，活化的Caspase-8能夠接近部分底物，如RIP。RIP在細(xì)胞膜上不同的切割，可以導(dǎo)致由Fas配體激活c-FLIPL和c-FLIPS對下游信號通路中 c-Fos或者 NF-κB的不同調(diào)節(jié)［6］。

2 c-FLIP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)節(jié)

越來越多的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子被發(fā)現(xiàn)結(jié)合在c-FLIP的啟動子上，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子對c-FLIP異構(gòu)體的不同調(diào)節(jié)，可能是以一種細(xì)胞依賴的方式，在特定刺激條件下決定細(xì)胞的命運(yùn)。

實(shí)驗(yàn)證明，調(diào)控c-FLIP的轉(zhuǎn)錄因子有NF-κB、p53、p63、FOXO3a、EGR1、AR、Sp1、E2F1、c-Myc、IRF5、c-Fos、NFATc2 和 hnRNPk［7-12］。NF-κB、p53、p63、NFAT、EGR1、hnRNPK、AR 和 Sp1 誘導(dǎo) c-FLIP的表達(dá);而 c-Myc、FOXO3a、c-Fos、IRF5 和 Sp3 抑制c-FLIP的轉(zhuǎn)錄。許多信號通路通過激活這些轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控c-FLIP，其中涉及到TNF配體、生長因子、白介素、趨化因子、DNA損傷試劑或者非傳統(tǒng)的化療試劑。TNF-α和 CD40配體可激活 NF-κB，導(dǎo)致c-FLIP表達(dá)上調(diào)從而抑制Fas、TNFR1和TRAIL受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［13］。另外 PI3K、Akt、MAPK信號通路的激活或者生長因子刺激，也可以誘導(dǎo)c-FLIP的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。趨化因子IL-8在前列腺癌細(xì)胞系中，通過激活NF-κB和雄性激素依賴的轉(zhuǎn)錄方式而增加 c-FLIPS和 c-FLIPL的 mRNA水平［14］。干擾素-β介導(dǎo)的IRF5(Interferon regulatory factor 5)的激活與PMA或者TRAIL誘導(dǎo)的c-Fos的激活可抑制 c-FLIP 的表達(dá)［15］。

c-FLIP異構(gòu)體的調(diào)節(jié)機(jī)制現(xiàn)在還不完全清楚，可能依賴于轉(zhuǎn)錄因子或者激活的信號通路，還可能依賴于特定的細(xì)胞系。在肺癌中，E2F1可抑制c-FLIPS而不是c-FLIPL的表達(dá)［2］;在活性T-細(xì)胞中c-FLIPS的表達(dá)上調(diào)特別依賴于 NFATc2［11］;CD40介導(dǎo)的c-FLIPR的表達(dá)上調(diào)可抑制Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。盡管c-FLIPL和c-FLIPS都受NF-κB調(diào)節(jié)，但在紅白血病細(xì)胞系TF-1中，c-FLIPR的表達(dá)是以不依賴于 NF-κB 的方式被 TNF 激活所誘導(dǎo)［16］。在HaCat細(xì)胞系中用RNAi篩選p63靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)，同一種轉(zhuǎn)錄因子對不同c-FLIP異構(gòu)體的調(diào)節(jié)可能不同。p63可能專門誘導(dǎo)c-FLIPR的表達(dá)，而抑制c-FLIPR并不影響c-FLIPL表達(dá)水平［7］。因此，有必要在不同細(xì)胞中研究c-FLIP異構(gòu)體的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

2．1 PKCε/NF-κB 信號通路對 c-FLIP 的調(diào)節(jié)NF-κB是真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，幾乎存在于所有的細(xì)胞中。在有害刺激(如病毒、脂多糖、佛波酯及dsRNA)等作用下，PKCε活化并激活NF-κB轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，與多種細(xì)胞因子、應(yīng)激相關(guān)等基因啟動子和增強(qiáng)子上的κB序列特異結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞因子的過表達(dá)和細(xì)胞在應(yīng)激條件下的存活和生長。研究發(fā)現(xiàn)［17］，PKCε 的活化可以增強(qiáng) c-FLIP mRNA 的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)c-FLIP表達(dá)上調(diào);而NF-κB活性的抑制則能抑制PKCε誘導(dǎo)的c-FLIP的表達(dá)上調(diào)。人T細(xì)胞白血?、裥筒《景┑鞍譼ax可以通過激活NF-κB誘導(dǎo)c-FLIP的表達(dá)，抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［18］。NF-κB抑制劑 DHMEQ可抑制 CLL細(xì)胞內(nèi) NF-κB的活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并伴隨NF-κB依賴的抗凋亡基因，如c-IAP、Bfl-1、Bcl-xL和 c-FLIP等基因的表達(dá)下調(diào)［19］。由此可見在上調(diào) c-FLIP表達(dá)的過程中，PKCε/NF-κB 信號通路以及 NF-κB 的活性起了至關(guān)重要的作用。

2．2 PI3K/Akt信號通路對c-FLIP的調(diào)節(jié) PI3K/Akt信號通路與細(xì)胞生長、增殖及癌變密切相關(guān)，是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PI3K催化磷脂酰肌醇(PI)磷酸化生成PIP3，在PIP3存在的情況下，磷脂酰肌醇依賴性激酶-1(Phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK-1)能磷酸化Akt/PKB并使之活化。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，PI3K通過Akt的磷酸化可增強(qiáng)c-FLIP mRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)水平［20］。PI3K抑制劑下調(diào)c-FLIP的表達(dá)，增強(qiáng)Fas介導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡的敏感性。盡管在口腔磷狀上皮細(xì)胞癌(OSCC)中，PI3K抑制劑Waltman和LY294002不影響OSCC細(xì)胞中Fas的表達(dá)，卻能強(qiáng)烈抑制Akt的磷酸化、顯著降低細(xì)胞內(nèi)c-FLIP的水平，促進(jìn)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［20］。c-Myc作為一個癌基因，在細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡中具有雙重作用。PI3K/Akt信號通路的激活可誘導(dǎo)c-Myc的轉(zhuǎn)錄，而c-Myc表達(dá)增加可使c-FLIP表達(dá)降低，促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［21，22］。染色質(zhì)免疫沉淀及熒光標(biāo)記分析顯示，c-Myc結(jié)合并抑制了c-FLIP的啟動子，c-Myc的表達(dá)增強(qiáng)了TRAIL誘導(dǎo)的DISC中Caspase-8的活性，從而促進(jìn)了c-FLIP的降解。在對TRAIL敏感的細(xì)胞系中，c-Myc的表達(dá)水平與細(xì)胞對TRAIL的敏感性呈正相關(guān)。過表達(dá)c-Myc或激活融合的Myc-ER(雌激素受體)，可增加TRAIL耐受細(xì)胞對TRAIL敏感性;如果用siRNA抑制c-Myc活性，能顯著降低c-Myc的表達(dá)和TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。c-FLIP是c-Myc的直接靶向作用蛋白，無論是在培養(yǎng)細(xì)胞還是在c-Myc誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的小鼠動物模型中，過表達(dá)c-Myc或者活化Myc-ER都能降低c-FLIP的表達(dá)水平，而用siRNA抑制c-Myc的活性則能增強(qiáng)c-FLIP的表達(dá)［21］。另外，補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物可以抑制凋亡蛋白Caspase-8的活化以及對Bid的切割，顯著提高c-FLIPL蛋白的表達(dá)水平。但是，PI3K抑制劑LY294002可逆轉(zhuǎn)C5b-9復(fù)合物的抗凋亡效應(yīng)［23］。綜上所述，PI3K/Akt信號通路對 c-FLIP的表達(dá)調(diào)控具有很重要的作用。

2．3 轉(zhuǎn)錄因子E2F1對c-FLIP的調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子E2F1是在細(xì)胞周期S期及細(xì)胞凋亡過程中起作用的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)［24］，低水平表達(dá)E2F1的肺癌細(xì)胞中，c-FLIPs特異性過表達(dá);在不同的肺癌細(xì)胞系中，E2F1可以通過下調(diào)c-FLIPS并激活死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體DISC中Caspase-8，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。E2F1可促進(jìn)Fas和TRAIL介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞抗腫瘤的細(xì)胞毒效應(yīng)。在原發(fā)性肺癌細(xì)胞中低水平的E2F1可能是促成細(xì)胞癌變的一個重要因素，其表達(dá)水平的下調(diào)將促成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。因此，在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中，E2F1是一個至關(guān)重要的細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。

2．4 其他 干細(xì)胞因子(SCF)可增強(qiáng) c-FLIP mRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)，減弱IFN-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。研究認(rèn)為［25］，雄激素可以提供前列腺上皮細(xì)胞生存信號，前列腺中雄激素的去除會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在雄激素存在的情況下，雄激素受體被募集到c-FLIP基因的啟動子上，誘導(dǎo)c-FLIP基因的表達(dá)，研究表明在雄激素作用下，雄激素受體可以通過調(diào)節(jié)c-FLIP基因影響前列腺細(xì)胞的存活和凋亡。TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性，除了與c-Myc和MEK/Erk誘導(dǎo)的Caspases活性增強(qiáng)之外，發(fā)現(xiàn)Akt-mTOR途徑也調(diào)控TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，該途徑不是增強(qiáng)細(xì)胞對TRAIL的敏感性及Akt的表達(dá)，而是通過mTOR及其靶蛋白S6激酶和eIF-4E起作用，選擇性地增強(qiáng)抗凋亡蛋白c-FLIPS的翻譯，阻抑TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［26］。

3 c-FLIP的翻譯后表達(dá)調(diào)節(jié)

除了轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)外，c-FLIP的異構(gòu)體在轉(zhuǎn)錄后水平還特別受到一些化合物的調(diào)節(jié)。這些化合物可以誘導(dǎo)c-FLIP的降解，增加死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性。c-FLIP異構(gòu)體是半衰期比較短的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)或RNA合成抑制劑可降低它們的表達(dá)水平［27］。c-FLIP異構(gòu)體的表達(dá)還受熱激效應(yīng)、E3泛素連接酶Itch激活的JNK通路以及泛素蛋白酶體途徑所調(diào)節(jié)，這些調(diào)節(jié)是磷酸化依賴的或者非依賴的方式。

c-FLIP通過蛋白酶體降解途徑比較復(fù)雜，可能因?yàn)閏-FLIP異構(gòu)體不同的調(diào)節(jié)機(jī)制以及c-FLIP異構(gòu)體不同的轉(zhuǎn)錄后修飾。c-FLIPS對泛素化降解更敏感，可能由于其獨(dú)特的 C-末端尾巴［28］。E3-泛素連接酶Itch是由JNK調(diào)控的，它可以使c-FLIP結(jié)合上泛素化鏈而通過蛋白酶體途徑進(jìn)行降解［1］。在FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，ROS也是通過蛋白酶體誘導(dǎo)c-FLIP下調(diào)［29］。NF-κB可通過抑制細(xì)胞中的ROS水平而抑制JNK活性，導(dǎo)致Itch連接酶活性的降低，從而穩(wěn)定細(xì)胞中c-FLIP的表達(dá)水平。c-FLIPL能被Itch泛素化，但c-FLIPL的泛素化并不需要CUL3，它也是一個E3連接酶，可以介導(dǎo)Caspase-8的泛素化?，F(xiàn)已證明Itch是c-FLIPS的泛素化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。c-FLIPL和c-FLIPS也可以不依賴于JNK 的方式進(jìn)行降解［30］。

c-FLIP的蛋白水平也受磷酸化的重要調(diào)節(jié)。c-FLIPS的Ser193磷酸化可以抑制它的泛素化，從而穩(wěn)定c-FLIPS在細(xì)胞中的表達(dá)水平而促進(jìn)細(xì)胞的存活［31］。c-FLIPL的Ser273可以被Akt以一種JNK和Itch依賴的方式磷酸化，這對于降低c-FLIP的水平是非常重要的［32］。相反，Akt能促進(jìn)E3連接酶Itch的多泛素化和降解，從而穩(wěn)定 c-FLIPs的表達(dá)［33］。在老鼠巨噬細(xì)胞中，蛋白激酶p38和c-Cbl可以使c-FLIPs特定氨基酸殘基磷酸化，促進(jìn) c-FLIPs和 E3連接酶 c-Cbl之間的相互作用［34］。

4 靶向c-FLIP的癌癥治療

c-FLIP的過表達(dá)可拮抗FasL和TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而抑制c-FLIP可以克服這種抗性。因此靶向c-FLIP，特別是與TRAIL或者傳統(tǒng)化療聯(lián)合處理，可能是癌癥治療的有效方法。

新陳代謝抑制劑，如蛋白質(zhì)合成抑制劑cycloheximide、anisomycin和RNA合成抑制劑actinomycin D最初用來研究抑制c-FLIP表達(dá)的分子機(jī)制［35，36］。研究顯示這幾種化合物能夠下調(diào)c-FLIP。用5-FU進(jìn)行化療也能夠下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞系中c-FLIPS和c-FLIPL的表達(dá)水平［37］。

蛋白酶體抑制劑在許多不同的細(xì)胞系中被廣泛研究，作用效果依賴于所研究的細(xì)胞系。在不同腫瘤細(xì)胞中，用Bortezomib或者小分子蛋白酶體抑制劑MG132處理之后可以增加或者降低c-FLIP的表達(dá)水平［38-44］，但 Bortezomib和 MG132都可以增加TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性。

DNA損傷試劑可以降低腫瘤細(xì)胞中c-FLIP的表達(dá)水平，然而這種表達(dá)水平在不同類型的細(xì)胞中是不同的。一些化療藥物可使c-FLIP表達(dá)水平升高，相反另外一些化療試劑可以降低c-FLIP表達(dá)水平。在卵巢癌細(xì)胞系中，Cisplatin可以使c-FLIP以p53依賴的方式進(jìn)行泛素化降解，主要是與p53、Itch形成一個三元復(fù)合體［45］。三元復(fù)合體所導(dǎo)致的c-FLIPL/S的泛素化是由Akt信號通路控制的。在p53野生型結(jié)腸癌 HCT116細(xì)胞中，oxaliplatin和CPT11都可以誘導(dǎo)c-FLIPS/L的表達(dá)下調(diào);而在p53突變的 HT29細(xì)胞中，oxliplatin和 CPT11誘導(dǎo) c-FLIP表達(dá)下調(diào)，并且藥物處理之后的細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加敏感，表明細(xì)胞凋亡與p53的狀態(tài)沒有關(guān)系［37］。在黑素瘤中 Cisplatin能下調(diào)c-FLIPs的表達(dá)，但不是 c-FLIPL;Cisplatin處理后，c-FLIPL脫磷酸化［46］。在膠質(zhì)瘤中 c-FLIPL被CaMKII磷酸化之后可以促進(jìn)c-FLIPL的在DISC中的募集而抑制Caspase-8結(jié)合，因此推斷c-FLIP的脫磷酸化會減弱它的抑制活性而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［47］。

組蛋白脫乙?；敢种苿┖屯?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑是新的癌癥治療藥物，能夠調(diào)節(jié)c-FLIP的表達(dá)水平。TSA處理可以降低卵巢癌細(xì)胞中c-FLIP的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，但并不影響c-FLIPs的表達(dá)水平。EGFR信號通路抑制劑可以阻抑TSA對c-FLIPL的調(diào)節(jié)。在肝癌細(xì)胞系中［48］，ITF2357和丙戊酸可以降低c-FLIP的mRNA和蛋白質(zhì)水平，但是研究并沒有區(qū)分不同的異構(gòu)體［49］。另外，通過RNAi干擾直接抑制 c-FLIP的翻譯可能是下調(diào)c-FLIP的最專一的方法［50］。但是在這些研究中，損傷或者修飾DNA的試劑靶向c-FLIP可能會有一定困難，因?yàn)樽饔糜赾-FLIP的效果在細(xì)胞類型之間是不同的，可能會影響兩種或者一種c-FLIP異構(gòu)體。盡管在體外研究中，用RNAi干擾直接靶向c-FLIP可以增加細(xì)胞對TRATL或者FasL誘導(dǎo)的凋亡更加敏感，然而在體內(nèi)使用RNAi干擾技術(shù)有許多限制，因此在臨床上抗用RNAi干擾方法靶向c-FLIP可能還需要一段時間。

5 展望

c-FLIP的選擇性抑制劑與一些配體(如TRAIL或者FasL)或傳統(tǒng)的化療藥物(如5-FU)聯(lián)合，可成為一種有效的腫瘤治療方法。合理的設(shè)計(jì)或者篩選c-FLIP的有效抑制劑，需要深入理解該種蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)機(jī)制以及不同異構(gòu)體的功能。另外，希望能開發(fā)一系列新的化合物，這些化合物可能會調(diào)節(jié)惡性腫瘤中c-FLIP不同異構(gòu)體的表達(dá)水平(通過結(jié)構(gòu)類似物競爭，蛋白酶體降解或者轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié))，甚至調(diào)控它們的比例。專門調(diào)節(jié)c-FLIP不同異構(gòu)體的表達(dá)可恢復(fù)死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性，通過調(diào)控配體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡為癌癥治療提供更有效的方法。

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