HP L C法測(cè)定樂(lè)舒洗液中蛇床子素的含量

馮 萍 毛桂福

1.廣西壯族自治區(qū)桂林市人民醫(yī)院，廣西桂林 541000；2.廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院，廣西柳州 545000

HP L C法測(cè)定樂(lè)舒洗液中蛇床子素的含量

馮 萍1毛桂福2

1.廣西壯族自治區(qū)桂林市人民醫(yī)院，廣西桂林 541000；2.廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院，廣西柳州 545000

目的 建立高效液相色譜法測(cè)定樂(lè)舒洗液中蛇床子素的含量。方法 采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-水（80︰20）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：322 nm；柱溫：30℃。結(jié)果 蛇床子素在0.28～36.8 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999）。蛇床子素的加樣回收率為98.2%，RSD值為4.0%（n=9）。結(jié)論 本方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于樂(lè)舒洗液中蛇床子素的測(cè)定。

樂(lè)舒洗液；高效液相色譜法；蛇床子素；含量測(cè)定

樂(lè)舒洗液是廣西柳州市婦幼保健院的傳統(tǒng)制劑，其主要成分有蛇床子、黃柏、苦參、百部、鶴虱、白鮮皮、花椒等，具有抗菌、消炎、止癢、收斂、殺滅陰道滴蟲(chóng)等作用。方中蛇床子為君藥，所含主要有效成分為蛇床子素[1-2]，具有抗菌、止癢、抗變態(tài)反應(yīng)、增強(qiáng)免疫力等作用。原標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)主要成分含量的測(cè)定項(xiàng)，為加強(qiáng)對(duì)該制劑的質(zhì)量控制，保證制劑療效，筆者在參考有關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了制劑有效成分蛇床子素的含量[3-7]。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

島津LC-20AT四元梯度高效液相色譜系統(tǒng)（LC-20AT泵，Rheodyne 7725i型進(jìn)樣閥，SPD-20A紫外檢測(cè)器，CTO-20A柱溫箱，DGu-20A在線脫氣機(jī)，日本島津），KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超生儀器有限公司），HANGPINGFA1004型電子天平（上海天平儀器廠）。

蛇床子素對(duì)照品（批號(hào)：110822-200305，中國(guó)藥品生物制品檢定所）。甲醇、乙腈為高效液相色譜純?cè)噭?，水為重蒸餾水，其他使用試劑均為分析純，樂(lè)舒洗液樣品（柳州市婦幼保健院制劑室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈-水（80︰20）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取蛇床子素對(duì)照品18.4 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得蛇床子素對(duì)照品儲(chǔ)備液，置-20℃冰箱保存。臨用前，精密取蛇床子素對(duì)照品儲(chǔ)備液2.0 mL，加甲醇稀釋并定容至 10 mL，即得 368.0 μg/mL的蛇床子素對(duì)照品工作液；精密取該蛇床子素稀釋液1.0 mL，加甲醇稀釋并定容至10 mL，即得36.8 μg/mL的蛇床子素對(duì)照品工作液。

2.2.2 供試品溶液 樂(lè)舒洗液超聲30 min后，精密量取4 mL置10 mL具塞玻璃試管中，加0.5 mL濃氨溶液，用4 mL乙酸乙酯振搖提取1 min，2000 r/min離心1 min，分取有機(jī)相至另一個(gè)10 mL離心管中并置95℃水浴氮?dú)獯蹈桑蔡崛?次（每次4 mL）。精密加2 mL甲醇至離心管中，渦旋溶解殘?jiān)?，?.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例取缺蛇床子的藥材，按照樂(lè)舒洗液制備工藝制備缺蛇床子陰性樣品，再按供試品溶液制備方法操作即得缺蛇床子陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性

分別取陰性樣品、混合對(duì)照品及供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（見(jiàn)圖1），結(jié)果表明，供試品色譜中蛇床子素保留時(shí)間為6.6 min，與對(duì)照品溶液的保留時(shí)間一致；陰性樣品在該色譜條件下對(duì)供試品測(cè)定無(wú)干擾，分離度良好。理論塔板數(shù)以蛇床子素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取蛇床子素對(duì)照品工作液適量至容量瓶中，加甲醇定容至5.0 mL，制成含蛇床子素分別為36.80、22.10、8.80、3.50、1.40、0.57、0.28 μg/mL 的系列對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。以對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蛇床子素的回歸方程：Y=88 037 X+7177，r=0.9999。結(jié)果提示，蛇床子素濃度在0.28～36.80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取1.4 μg/mL蛇床子素對(duì)照液，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD值為0.56%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果提示，蛇床子素的RSD值為2.86%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，于0、3、6、12 h分別進(jìn)樣測(cè)定4次，記錄峰面積。蛇床子素的RSD值為2.46%（n=12），表明樣品室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密移取4 mL已知含量的樣品9份，分別置于10 mL離心管中，分別加入一定量的蛇床子素對(duì)照液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，測(cè)定蛇床子素的含量并計(jì)算回收率，結(jié)果提示，蛇床子素的平均回收率為98.15%，RSD為3.96%，見(jiàn)表1。

表1 蛇床子素的加樣回收率試驗(yàn)

2.9 樣品含量測(cè)定

分別取5批樣品（20110422、20110818、20120204、20120516、20120810），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，5批樣品中蛇床子素的含量分別為 0.330、0.440、0.503、0.580 和 0.390 μg/mL。

3 討論

本試驗(yàn)曾考察了幾種不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，最后確定用乙腈-水（80︰20）作為流動(dòng)相，蛇床子素與其他成分能達(dá)到基線分離，不含緩沖鹽，有利于色譜系統(tǒng)的維護(hù)。

本研究曾在相同條件下比較了乙酸乙酯、乙醚等溶劑的提取效率，結(jié)果表明乙醚和乙酸乙酯對(duì)蛇床子素提取率相當(dāng)。在提取過(guò)程中用離心法分離有機(jī)相，能大量縮短提取液分層的時(shí)間，利于提高萃取工作效率。本制劑中含有明礬，沉淀較多，超聲后直接制成供試液進(jìn)行測(cè)定，蛇床子素的回收率較低；濾除沉淀后制成供試液，蛇床子素的回收率有大幅度的提高，表明沉淀對(duì)蛇床子素有較大的吸附作用。

按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，蛇床子藥材中蛇床子素含量不得少于1.0%[8]。處方中樂(lè)舒洗液每1毫升相當(dāng)于飲片量為15 mg，以上述含量指標(biāo)折算，樂(lè)舒洗液中蛇床子素含量理論上應(yīng)大于150 μg/mL。內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)按80%轉(zhuǎn)移率計(jì)算，樂(lè)舒洗液中蛇床子素含量應(yīng)不少于120 μg/mL。從上述5批樂(lè)舒洗液樣品測(cè)定結(jié)果來(lái)看，蛇床子素含量大大低于內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)含量。如下幾個(gè)因素可能是蛇床子素含量偏低的原因：制備工藝不科學(xué)，蛇床子素的脂溶性極大，制備工藝中只是用水煮沸提取2次，可能造成提取率偏低；處方設(shè)計(jì)不科學(xué)，處方中乙醇含量（0.4%）低，熱水提取的蛇床子素，冷卻后可能大部分都沉淀了；制劑中含有明礬，其形成的膠體可能會(huì)吸附大部分的的蛇床子素，或者其中的金屬離子可能會(huì)與生物堿反應(yīng)形成不溶性沉淀。曾經(jīng)對(duì)未過(guò)濾的制劑進(jìn)行含量測(cè)定，蛇床子素的含量在1.0～16.9 μg/mL。曾經(jīng)取未過(guò)濾的制劑進(jìn)行了回收率試驗(yàn)，加樣回收率只有87%左右，但取續(xù)濾液進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)是符合要求的（98%以上）。由此可見(jiàn)，樂(lè)舒洗液的制備工藝和處方需要進(jìn)一步的改進(jìn)。

[1]陳艷，張國(guó)剛，余仲平.蛇床子的化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（4）：256-260.

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Determination of osthol in Leshu lotion by HPLC

FENG Ping1MAO Guifu2
1.The People's Hospital of Guilin City in Guangxi Zhuang Autonomous Region,Guilin 541000,China;2.Women and Children's Health Care Hospital of Liuzhou City in Guangxi Zhuang Autonomous Region,Liuzhou 545000,China

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of osthol in Leshu Lotion.MethodsThe sample was separated on Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)column,with a mixture of acetonitrile-water（80︰20）at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 320 nm and the column temperature was set at 30℃.ResultsThe linear range of the calibration for osthol was 0.28-36.8 μg/mL(r=0.9999).The average recoveries was 98.2%(RSD=4.0%,n=9).ConclusionThe method is sample,accuracy,and suitable for determination of osthol in Leshu Lotion.

Leshu lotion;High performance liquid chromatography;Osthol;Content determination

R927.2

A

1674-4721（2013）04（b）-0066-02

廣西壯族自治區(qū)柳州市應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)計(jì)劃課題（編號(hào)：2011J0302035）。

馮萍，性別：女；職稱：主管藥師；研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。

毛桂福，性別：男；職稱：副主任藥師；研究方向：主要從事藥物分析與臨床藥學(xué)研究工作。

2013-02-04 本文編輯：袁 成）