RET融合基因在非小細胞肺癌診治中的意義

劉婧婧 綜述 畢明宏 審校

目前，肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)位居各類惡性腫瘤之首[1]，預計到2030年肺癌的歸因死亡將占全球所有死亡原因的3.1%，這是一個驚人的數(shù)字[2]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%-85%，主要包括腺癌、鱗癌、大細胞癌、腺鱗癌、肉瘤樣癌等，其中腺癌較易發(fā)生于女性及不吸煙者，近30年來所占比例有明顯上升趨勢。早期發(fā)現(xiàn)肺癌患者并給予及時適當?shù)闹委?，可以獲得好的治療效果[3]，然而80%以上的患者就診時已失去手術根治的最佳時機，目前第三代含鉑兩藥方案聯(lián)合化療是晚期NSCLC的標準一線治療方案，但其療效似乎已達平臺：有效率僅為25%-35%、中位生存期為8個月-10個月、1年生存率為30%-40%[4]。

近年來隨著腫瘤分子生物學的發(fā)展，人們逐漸認識到肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移是一個多階段、多步驟、多基因參與調(diào)控的復雜的生物學過程。目前，通過尋找在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用的靶分子及信號途徑，進行肺癌的分子分型及靶向治療成為肺癌研究領域的熱點。分子靶向治療以其符合生理、低毒和理論上高效的特點，讓人們看到了跨越這一平臺的希望和曙光，是目前治療晚期NSCLC最具前景的研究領域。

自2011年底開始陸續(xù)有報道RET（rearranged during transfection）融合基因存在于肺癌患者中，并且該基因具有可識別的臨床病理特征，RET抑制劑抗腫瘤有效，提示RET融合基因可能是繼表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變、KRAS（kirsten-rous avian sarcoma）突變、棘皮動物微管相關蛋白樣4-間變淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK）融合基因后又一特異性較高的分子標記物?，F(xiàn)將相關研究做一介紹。

1 RET融合基因

1.1 RET原癌基因與疾病 1985年Takahashi與Cooper等[5]在重組DNA的實驗中，首次發(fā)現(xiàn)RET原癌基因。RET原癌基因定位于10號常染色體長臂（10q11.2），現(xiàn)已確定其DNA全長約8萬個核苷酸（60 kb），有21個外顯子，至少有4個轉錄產(chǎn)物，且在不同的組織中含量不同[6,7]。由RET原癌基因編碼的RET蛋白是一種受體酪氨酸激酶，為1,114個殘基跨膜蛋白，它有著受體酪氨酸激酶的經(jīng)典結構：一個富含半胱氨酸的鈣粘連素樣細胞外區(qū)，一個跨膜區(qū)和一個催化酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK）的細胞內(nèi)區(qū)。受體與配體結合后胞內(nèi)區(qū)的TK磷酸化，激活下游信號轉導通路，調(diào)節(jié)細胞生存并誘導細胞增生[6]。RET基因突變在多方面增強了RET TK信號轉導的功能，進一步促使激酶的活化和原癌基因的轉化[8]。RET原癌基因能與多種基因發(fā)生融合，常以本身斷裂再與另一基因接合的方式重組成一個新的基因（融合基因），從而逃脫受體結合配體的調(diào)控，進行自我磷酸化、自動傳導信號，引發(fā)腫瘤生成。

之前的研究提到RET基因突變是甲狀腺癌癥的誘因，不同形式的染色體異位和插入導致PTC/RET融合基因的形成，被認為是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma, PTC）的驅動突變[9]。隨著研究的不斷深入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RET基因突變與多種疾病的發(fā)生密切相關，包括多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2型[7]、PTC、甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma, MTC）[10]、先天性巨結腸[11]和近期發(fā)現(xiàn)的肺腺癌（lung adenocarcinomas, LADCs）[12]等。

1.2 KIF5B（kinesin family member5B）基因 KIF5B基因位于10號常染色體短臂（10p11.22），編碼KIF5B蛋白，該蛋白是Kinesin驅動蛋白家族1的成員，含有約350個氨基酸殘基，是由單體組成的同四聚體，內(nèi)有三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）結合位點和微管結合位點，其“頭部”具有ATP酶活性，能通過水解ATP獲得能量，改變構型，且只能以微管構成的軌道朝一個方向滑行。KIF5B的蛋白結構域—LC-S6在啟動基因融合事件中不可或缺，它具有一個蜷曲螺旋結構，可以沿著細胞微管運動，使RET蛋白聚合從而導致自體活化，自發(fā)誘導下游磷酸化信號轉倒。KIF5B和RET通過臂間倒位后融合形成KIF5B-RET融合基因[13]，導致多種腫瘤生成。

1.3 CCDC6（coiled-coil domain-containing protein 6）基因CCDC6基因位于10號常染色體長臂（10q21），編碼的卷曲螺旋結構域蛋白6參與形成細胞骨架結構。CCDC6-RET基因常見于甲狀腺癌樣本中，它的過表達會導致腫瘤的發(fā)生，被認為是PTC/RET的典型驅動突變基因[9]。也有報道[14,15]指出CCDC6和RET的融合可能導致LADCs的發(fā)病。

1.4 TRIM33（tripartite motif-containing 33）基因 也稱RFG7或TIF1，位于1號常染色體短臂（1p13.1），是轉錄中介因子家族的成員之一，控制參與細胞分化[16]。已有報道[17]證實TRIM33和RET的融合與PTC的致病有關，我們期待能夠證實TRIM33-RET基因在NSCLC中也有臨床意義。

1.5 NCOA4（nuclear receptor coactivator 4）基因 NCOA4基因位于10號常染色體長臂（10q11.2），在睪丸、腎上腺、甲狀腺、胸腺、前列腺等多種組織中廣泛表達。近期有報道[18]在NSCLC中發(fā)現(xiàn)1例NCOA4-RET陽性患者，提示NCOA4-RET融合基因或許也對NSCLC有臨床意義。我們相信隨著研究的不斷深入，未來會發(fā)現(xiàn)更多有意義的新的融合位點。

2 RET融合基因的檢測方法

目前已報道的常用RET融合基因檢測方法包括免疫組化（immunohistochemistry, IHC）、熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization, FISH）、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）等，其中PCR又包括逆轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）、cDNA末端快速擴增技術（rapid amplification of cDNA ends, RACE）和DNA測序技術。多數(shù)學者采用RT-PCR法進行檢測，也有采用FISH檢測，但目前仍無敏感特異穩(wěn)定的方法用于該分子的檢測。研究證明FISH與RT-PCR的檢測結果一致，但與IHC的匹配欠佳[19]。這提示前二者可能是檢測RET基因狀態(tài)的最佳選擇，且各有優(yōu)勢。我國陳海泉教授及其團隊通過不斷摸索，創(chuàng)造發(fā)明了一種高效、準確、低廉的檢測方法——“基于表達不平衡的RET融合基因檢測”。目前，這種檢測方法及其主要技術要素已申請國家發(fā)明專利，有望得到進一步推廣和應用。

3 RET融合基因在NSCLC中的表達及其臨床病理學特點

我國研究者對中國LADCs人群進行基因突變篩查的結果顯示：EGFR突變率為66.3%，KRAS突變?yōu)?.3%[20]。國外研究[21]提示LADCs中EGFR基因突變率為15%，KRAS基因突變率約為25%，EML4-ALK融合基因突變率約為5%，其他約15%，至今仍有約40%的基因突變尚不明確。2011年12月，韓國Ju等[22]在1例肺癌患者身上首次發(fā)現(xiàn)KIF5B-RET融合基因，隨后陸續(xù)出現(xiàn)對RET融合基因進行研究和報道，提示肺癌中存在新的分子亞型—RET融合基因型肺癌。RET基因與其他基因融合已被證實是甲狀腺癌癥的誘因[9,10,17]，現(xiàn)有研究提示它在肺中表達水平低，但是在患者肺中高表達，RET融合基因可能成為LADCs的新驅動基因。

韓國Ju[22]等應用轉錄組高通量測序技術對1例33歲、無癌癥家族史、從不吸煙的男性肺腺癌肝轉移灶的標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)了一種新的融合基因：KIF5B-RET，為KIF5B的16號外顯子與RET的12號外顯子相融合，其腫瘤組織EGFR、KRAS、EML4-ALK均為陰性。隨后對20例LADCs樣本進行定向測序分析，再次發(fā)現(xiàn)2例KIF5B-RET融合基因陽性患者（5例EGFR、KRAS、EML4-ALK均為陰性的LADCs患者中發(fā)現(xiàn)1例；15例EGFR、EML4-ALK均陰性的患者中發(fā)現(xiàn)1例），陽性率約為6%（4.3%-8%）。RET基因的12號外顯子分別與KIF5B的15、23號外顯子相融合，這種融合可導致RET原癌基因的高表達。這證實了KIF5B-RET融合型NSCLC的存在，并提示該融合基因可成為肺癌個體化診治中新的分子靶點。

日本Takeuchi等[23]經(jīng)分子和組織病理學檢測1,529例肺癌（其中1,116例為LADCs）的融合基因表達情況，采用IHC或FISH技術分別分析了ALK、ROS1（sarcoma virus oncogene homolog 1）、RET這3種融合基因的頻率分布。共檢出71例肺癌患者存在融合基因，其中44例ALK、13例ROS1和14例RET（12例為KIF5B-RET融合，2例為CCDC6-RET融合）。這71例病理類型均為LADCs，即0.9%肺癌（1.2% LADCs）患者存在RET融合基因，且研究發(fā)現(xiàn)RET基因的斷裂位點相對保守，14例陽性標本中11例位于12外顯子，1例位于11外顯子，1例未知。該研究中RET融合基因陽性患者EGFR、KRAS為陰性，具有年輕、少吸煙、腫塊小的特點，其總生存期（overall survival, OS）與EGFR突變陽性患者相比無明顯差別（P=0.32）。該研究通過這71例融合基因確定了4個獨立的不良預后因素：年齡≥50歲、男性、高病理分期、融合基因陰性。

日本Kohno等[12]對319例日本肺腺癌標本行RT-PCR和Sanger測序分析顯示，6例（1.9%）KIF5B-RET陽性均為非吸煙腺癌，癌組織高表達RET，腫瘤病理類型均為中分化或高分化，同時EGFR、KRAS、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2, HER-2）及ALK均為陰性。RET融合基因存在4種變體（K15：R12，K16：R12，K23：R12，K24：R8）。但是，研究者對80例美國肺癌患者及34例挪威肺腺癌患者進行檢測時，僅從1例美國曾經(jīng)吸煙肺腺癌患者中發(fā)現(xiàn)了KIF5B-RET基因融合。KIF5B-RET融合基因在亞裔和非亞裔LADCs中陽性率為1%-2%，而在其他肺癌類型包括234例鱗狀細胞癌、l7例大細胞癌、20例小細胞癌中均未檢測到KIF5B-RET融合基因；在其他腫瘤的腺癌中，例如卵巢癌（n=100）、結腸癌（n=200）亦未檢測到KIF5B-RET融合基因，這一結果提示KIF5B-RET融合基因為LADCs所特有。且RET基因的斷裂位點相對保守，以上7例RET陽性樣本中6例位于12號外顯子，1例位于8號外顯子。

美國Dana Farber癌癥研究所Capelletti等[24,25]通過二代測序技術檢測24例肺癌的常規(guī)石蠟包埋組織標本，發(fā)現(xiàn)了1例KIF5B-RET融合變異。另外利用IHC技術在117例NSCLC患者中檢測到22例RET陽性，對其中15例患者進行測序發(fā)現(xiàn)1例攜帶KIF5B-RET融合基因。檢測另外526例（121例白人和405例亞裔）從不或很少吸煙的肺癌患者的融合基因情況，共發(fā)現(xiàn)1例白人（0.8%）和9例亞裔（2%）為KIF5B-RET陽性，且所有10例RET融合基因陽性患者均無EGFR、KRAS、Her-2、ALK、ROS1的改變。Capelletti研究的667例肺癌標本中KIF5B-RET基因融合頻率約為1.8%（12/667），在沒有EGFR、KRAS、Her-2、ALK、ROS1變異的肺癌中，RET基因的融合頻率高達6.3%（10/159例）。該研究中發(fā)現(xiàn)4種KIF5B-RET融合基因的變體（K15：R12、K16：R12、K22：R12和K15：R11），可以看出RET基因的斷裂位點較為保守。

Suehara等[26]綜合應用NanoString、せCE和RT-PCR在74例KRAS、EGFR、HER-2、BRAF（murine sarcoma viral oncogene homolog B1）均無突變且ALK融合基因為陰性的LADCs中檢測出2例KIF5B-RET陽性患者，其中1例為60歲從不吸煙的女性患者，1例為73歲曾經(jīng)吸煙的男性患者。

日本Yokota等[27]采用RT-PCR技術及直接測序法對442例術后患者（270例肺腺癌、101例肺鱗癌、60例乳腺癌、11例來自結腸癌和PTC的轉移性肺癌）的KIF5B-RET基因狀態(tài)進行研究，結果檢出3例KIF5B-RET陽性且均為LADCs（1.1%），其他172例肺鱗癌、乳腺癌、轉移性肺癌的KIF5B-RET融合基因均為陰性。這3例KIF5B-RET陽性患者均為女性，無吸煙史、無EGFR、KRAS、BRAF、ERBB2、EML4-ALK基因變異。

我國季紅斌課題組[14]在前期工作中已經(jīng)揭示了絕大多數(shù)LADCs中存在關鍵致癌驅動基因。只有少數(shù)LADCs（24/202）的關鍵致病基因仍在進一步探究：選取5例EGFR、HER2、KRAS、EML4-ALK均為陰性和12例致癌驅動機制已明確的腫瘤樣本進行Affymetrix外顯子芯片的分析及實驗驗證，最終在這些非吸煙LADCs標本中檢出1例CCDC6-RET融合基因，并且進一步證實為CCDC6的1號內(nèi)含子和RET的11號外顯子在染色體DNA水平的轉位所致。RET是一個受體酪氨酸激酶，在正常的肺組織中表達較低；而融合了CCDC6胞外域以及RET激酶活性區(qū)的突變基因，在肺癌樣本中往往表達較高，可能是導致肺癌發(fā)病的關鍵所在。

我國復旦大學癌癥中心的王瑞博士與陳海泉博士等[18]應用PT-PCR結合實時定量PCR的方法對936例術后NSCLC患者的RET融合基因情況進行研究，再通過IHC和FISH對所得結果進行驗證。檢測到13例患者（633例腺癌患者中有11例，24例腺鱗狀細胞癌患者中有2例）存在RET融合基因，其中9例為KIF5B-RET，3例為CCDC6-RET，1例為首次發(fā)現(xiàn)的NCOA4-RET融合基因。RET融合基因陽性的LADCs患者，平均無復發(fā)存活期為20.9個月，其腫瘤分化情況較差（63.6%, RET vs ALK,P=0.029; RET vs EGFR, P=0.007），患者年齡偏低（≤60歲；72.7%），不吸煙者（81.8%）多發(fā)，并且多見實體亞型（63.6%）、瘤體較小（≤3 cm）、有N2病情（54.4%）。

Drilon[28]報道了在臨床研究中應用新一代測序法首次發(fā)現(xiàn)1例TRIM33-RET融合基因陽性的NSCLC患者，并進一步證實為TRIM33的14號外顯子和RET的12號外顯子相融合，且無MET基因突變。

目前已報道的研究顯示我國RET融合基因存在于1.4%的NSCLC患者以及1.7%的LADCs患者中[18]，國外數(shù)據(jù)為RET融合基因占NSCLC患者的1%-2%[28]（其中KIF5BRET占90%，相繼發(fā)現(xiàn)的CCDC6-RET、NCOA4-RET、TRIM33-RET數(shù)量較少，尚不能得出有力結論），并且該基因具有可識別的臨床病理特征，與其他已知的NSCLC分子亞型相互獨立、不相重疊，因此可定義為一項全新的分子亞型，對其進行靶向治療研究，進一步應用于臨床工作。

4 RET抑制劑的抗腫瘤作用

已有研究[29]表明RET融合基因可誘導甲狀腺癌的發(fā)生，給予RET抑制劑后腫瘤可得到控制，然而在肺癌中相關報道較少。

多靶點激酶抑制劑凡德他尼（vandetanib）是血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2）、EGFR和RET信號通路的抑制劑。一項凡德他尼治療局部晚期或轉移性家族遺傳性MTC的II期臨床試驗[29]結果表明，疾病控制率達到73%，且不良反應可以得到控制；另一項關于MTC的III期臨床試驗（ZETA）[30]結果顯示，凡德他尼組較安慰劑組無進展生存期（progression-free survival, PFS）明顯延長，疾病進展風險降低54%。因此，凡德他尼已被美國食品藥品管理局批準用于不宜手術切除或轉移性MTC的治療。眾多學者對于凡德他尼治療RET融合基因陽性的NSCLC患者是否有效進行了研究。

Kohno等[12]對僅表達KIF5B-RET融合基因而無其他基因變異的H1299人肺癌細胞進行研究，檢測到KIF5BRET蛋白在RET激酶活化環(huán)上Tyr905發(fā)生磷酸化，證實了KIF5B-RET的融合導致RET激酶異常活化。研究發(fā)現(xiàn)凡德他尼（＜1 μmol/L）能夠抑制轉染表達KIF5B-RET融合基因的NIH3T3細胞模型生長及體外克隆形成，提示該藥能夠抑制Tyr905的磷酸化，抑制KIF5B-RET融合基因的活化。Takeuchi等[23]將轉染了KIF5B-RET病毒的3T3細胞接種于裸鼠皮下，可觀察到腫瘤形成。凡德他尼能夠抑制轉染了KIF5B-RET病毒的Ba/F3細胞增殖。Capelletti等[24]進一步發(fā)現(xiàn)，轉染了KIF5B-RET變體K15：R12的Ba/F3細胞顯示出RET的高表達和磷酸化活化，體外實驗發(fā)現(xiàn)，多靶點激酶抑制劑舒尼替尼（sunitinib）、索拉非尼（sorafenib）和凡德他尼均能夠抑制KIF5B-RET Ba/F3細胞的增殖，且舒尼替尼能夠抑制RET磷酸化，但EGFR-TKI吉非替尼（gefitinib）無以上作用。

目前兩項凡德他尼單藥治療NSCLC的III期臨床試驗正在進行中。關于凡德他尼與厄洛替尼（erlotinib）的對照試驗—ZEST試驗[31]結果顯示兩組PFS、客觀有效率（objective response rate, ORR）和OS均無明顯差異。Lee等[32]設計的ZEPHYR試驗將符合條件的患者按2:1的比例隨機分到凡德他尼組（300 mg/d）和安慰劑組，接受治療直至疾病進展或發(fā)生不能耐受的毒性反應，該研究的主要目標為OS，最終納入924例患者，凡德他尼組617例，安慰劑組307例。結果顯示，常見的不良事件凡德他尼組多于安慰劑組，包括腹瀉（46% vs 11%）、皮疹（42% vs 11%）和高血壓（26% vs 3%）。8周時凡德他尼組PFS（危險比=0.63，P＜0.001）和ORR（2.6% vs 0.7%, P=0.028）均優(yōu)于安慰劑組；然而兩組的中位OS無差異（8.5個月vs 7.8個月，P=0.527），凡德他尼組PFS的延長未能最終轉化為OS的獲益。因此，我們期待一項新的隨機、雙盲、多中心臨床試驗出現(xiàn)，將篩選出的RET融合基因陽性患者，隨機分到凡德他尼組和對照組進行研究，在試驗的初期更精確的鎖定治療靶點，或許能夠得出更有意義的結果。

Cabozantinib即XL184，是一種口服廣譜激酶抑制劑，通過靶向抑制MET（mesenchymal-epithelial transition factor）、VEGFR2 及RET信號通路而發(fā)揮抗腫瘤作用，它能夠殺死腫瘤細胞，減少轉移并抑制血管生成[33]。研究[33]表明Cabozantinib對于RET-PTC的細胞株（IC50為0.06 μM）治療效果優(yōu)于阿西替尼（Axitinib）、舒尼替尼、凡德他尼，鑒于此斯隆凱瑟琳癌癥中心啟動首個Cabozantinib治療KIF5B-RET陽性的進展期NSCLC患者的II期臨床試驗（NCT01639508）。Drilon等[28]對此項研究進行了報道，該試驗共招募25例符合條件的患者接受口服Cabozantinib 60 mg/d治療，連續(xù)28天為一個周期，直至疾病進展或發(fā)生不可耐受的藥物相關毒性。該研究主要目標為ORR，次要目標為PFS、OS和不良反應，目前第一階段已順利完成，3例經(jīng)過Cabozantinib治療的患者中有2例達到部分緩解（RECIST 1.1評價標準）：其中1例為TRIM33-RET融合基因陽性患者（這也是首例被報道的TRIM33-RET陽性的NSCLC患者）；另外1例KIF5B-RET陽性患者達到穩(wěn)定。這3例患者目前仍在繼續(xù)接受治療，此項研究預計最終于2015年7月全部完成。

5 結語及展望

分子分型的出現(xiàn)為晚期NSCLC的治療開創(chuàng)了全新局面。RET融合基因成為NSCLC的一個新的分子亞型，有著獨特的臨床病理學特征：多為不吸煙（或少吸煙）的較年輕的腺癌患者，其腫瘤分化情況較差，瘤體較小，有N2病情，與其他已知的基因改變不共存，RET抑制劑治療有效。雖然RET融合基因在肺癌中的發(fā)生率很低，但由于肺癌在全世界高發(fā)，如能結合臨床病理學特點，對EGFR突變、KRAS突變、EML4-ALK基因均陰性的肺腺癌患者進一步行RET融合基因檢測，并對陽性患者進行針對性靶向治療，相信會使更多患者獲益。

在肺癌中，RET融合基因的藥物臨床試驗及分子診斷技術方法成為新的研究熱點，RET融合型肺癌的診治模式已經(jīng)初露端倪。當然，真正形成類似目前EGFR突變型、ALK融合型肺癌的診治模式，還需要高水平、大規(guī)模、前瞻性臨床試驗的證據(jù)支持。目前所檢測到RET融合基因陽性的肺癌幾乎均為腺癌，類型較為單一，但由于相關研究較少，其他類型肺癌中是否存在RET融合基因、是否還存在其他基因與RET基因融合的現(xiàn)象都有待進一步的探索。多靶點激酶抑制劑凡德他尼、克唑替尼、Cabozantinib等能否成為該分子亞群肺癌治療的里程碑，也有待更多更深入的實驗室研究、轉化性研究及大規(guī)模前瞻性多中心隨機對照臨床研究加以佐證。但是我們相信不久的將來會有相應的藥物給肺癌患者帶來新的希望。