動物脂肪沉積的分子調(diào)控機制

滑留帥，王 璟，李明勛，孫曉梅，楊東英，陳 宏＊

引言

長期以來，脂肪組織一直被當做是具有能量的儲存功能，用于調(diào)節(jié)機體的能量穩(wěn)態(tài)平衡，當能量供應(yīng)充足時，脂肪細胞儲存甘油三酯，而當能量供應(yīng)不足時，脂肪細胞釋放甘油三酯以供能。1994年，首個脂肪細胞因子Leptin被鑒定［1］，之后又有一系列的脂肪細胞因子被發(fā)現(xiàn)，例如TNFa（tumour necrosis factor－a），脂聯(lián)素（adiponectin）、抵抗素 （resistin）、adipsin、visfatin、白介素 6（interleukin，IL－6，chemokines等［2］。這些脂肪細胞因子的發(fā)現(xiàn)讓人們逐漸認識到脂肪組織是一個復雜且高度活躍的分泌結(jié)構(gòu)，對于調(diào)節(jié)機體代謝至關(guān)重要，它參與包括食欲、能量平衡、胰島素敏感性、繁殖、骨形成、炎癥反應(yīng)和免疫等一些過程的調(diào)控［2，3］。

由于脂肪組織對機體具有豐富的調(diào)控功能，且脂肪功能紊亂多與人類的肥胖癥、II型糖尿病等人類重大疾病相關(guān)聯(lián)，動物脂肪沉積的分子調(diào)控機制的研究也備受人們關(guān)注，本文綜述了目前在模式動物上研究的相對較為透徹的一些調(diào)控通路以及調(diào)控因子。

1 PPARg和C／EBPs是脂肪細胞分化調(diào)控的核心基因

多潛能的MSCs在分化過程中形態(tài)和功能都發(fā)生了轉(zhuǎn)變，梭形的成纖維細胞變成了圓形的富含脂滴的成熟的脂肪細胞，這個過程包含復雜的調(diào)控因子和調(diào)控通路的互作。目前研究比較透徹的包括：CAAT／enhancer binding proteins （C／EBPs），peroxisome proliferator－activated receptor gamma（PPARg），adipocyte determination and differentiation－dependent factor－1／sterol regulatory elementbinding protein－1（ADD－1／SREBP－1）等。在受到脂肪分化因素的刺激后，C／EBPb和C／EBPd首先被誘導表達，然后進一步誘導PPARg和C／EBPa自反饋環(huán)的表達。其中C／EBPa表達后可以結(jié)合在PPARg的啟動子區(qū)誘導PPARg的表達，而表達PPARg又能進一步增加C／EBPa的表達。在PPARg和C／EBPa的相互作用下，脂肪細胞特異性基因被進一步誘導表達［4，5］。這些基因多與甘油三酯的合成與儲存有關(guān)，如脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid－binding protein，aP2），脂酰輔酶 A 合成酶（ac－yl－CoA synthetase），脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白（fatty acid transport protein－1），脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）等［6］。

PPARg屬于配體激活轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族的一員，抗糖尿病藥物TZD（thiazolidinedione）的靶基因就是PPARg。早期工作表明PPARg是誘導脂肪分化的充分且必需條件，直到目前為止，沒有哪個基因能夠在缺失PPARg的情況下啟動脂肪細胞的分化［7］。另外體內(nèi)和體外的研究都證明PPARg對于成熟脂肪細胞的功能維持同樣非常的重要。在3T3－L1細胞中利用RNAi敲低PPARg，能夠?qū)е轮炯毎禺愋源x基因的表達降低和對胰島素敏感性的降低，但是細胞的形態(tài)并沒有發(fā)生變化。在小鼠模型上，敲除脂肪組織中的PPARg，能夠?qū)е录毎牡蛲觯@說明成熟脂肪細胞的生存和脂滴含量的維持需要一定量的PPARg，例如在RNAi試驗中敲低PPARg能夠繼續(xù)維持細胞的形態(tài)，但是在小鼠模型中完全敲除PPARg則導致細胞不能存活［8，9］。

PPARg基因有兩個剪切體PPARg1和PPARg2，他們分別由不同啟動子啟動。其中PPARg2特異性的在脂肪細胞中高表達，而PPARg1還在多個組織中廣泛表達［10］。作為一個核受體，PPARg擁有其他類似的二級結(jié)構(gòu)，如配體依賴激活域、DNA結(jié)合域，鉸鏈域和配體結(jié)合域。PPARg能與視黃酸受體a（Retinoid X Receptor a，RXRa）結(jié)合形成異源二聚體，然后結(jié)合在靶基因的PPRE（peroxisome proliferator response elements）上啟動靶基因的表達，因此視黃酸能夠通過RXRa與PPARg的互作來影響脂肪的生成［11］。通過全基因組分析表明，在3T3－L1細胞中PPARg大約有5 300個結(jié)合位點，大部分都與PPRE元件有關(guān)，并且同時與RXRa相結(jié)合。有許多已知的PPARg靶基因都含有多個PPRE元件。PPARg能夠在沒有配體的情況下與靶基因相結(jié)合，這時它往往與共抑制因子 NCoR（nuclear receptor corepressor）和SMRT（silencing mediator for retinoid and thyroid receptors）相關(guān)聯(lián)。這兩個共抑制因子能夠招募組蛋白去乙?；负推渌旧w修飾酶來抑制轉(zhuǎn)錄。NCoR、SMRT和組蛋白去乙酰化酶如Sirt1和Sirt2屬于脂肪分化的負調(diào)控因子［12－14］。配體的結(jié)合能夠?qū)е翽PARg構(gòu)象的改變，從而為共激活因子，如類固醇受體共激活因子（steroid receptor coactivators，SRCs），產(chǎn)生一個結(jié)合位點（docking site）。許多研究分析了共調(diào)控因子在脂肪分化中是必需的。受體互作蛋白140（Receptor－interacting protein 140，RIP140）作為一個共調(diào)控因子，能夠結(jié)合在配體受體上進而抑制轉(zhuǎn)錄，例如RIP140能夠抑制PGC1a（peroxisome proliferator－activated receptor－g coactivator－1a，PGC－1a）的活性。PGC1a作為 PPARg的一個共激活因子能夠誘導線粒體的生成和UCP－1（uncoupling protein 1）的表達，從而對能量消耗和棕色脂肪的發(fā)育有關(guān)鍵的調(diào)控作用［15］。

C／EBPs（包括C／EBPa、C／EBPb和C／EBPd三種亞型）屬于一類高度保守的亮氨酸拉鏈蛋白，他們在脂肪細胞分化的調(diào)控中也具有核心的作用，敲除C／EBPs基因能導致嚴重的脂肪異常［16］。全身敲除C／EBPa的小鼠出生后很快會因為肝臟發(fā)育缺陷、低血糖、白色和棕色脂肪不能沉積脂質(zhì)而死去。即便肝臟功能被恢復，也完全沒有白色脂肪的沉積，但是乳腺和棕色脂肪發(fā)育正常，這樣的動物往往伴隨著顯著的代謝異常，如高血脂、高胰島素和脂肪肝等。在成年小鼠中全身敲除C／EBPa能夠?qū)е缕は轮镜臏p少，說明C／EBPa對于成熟的脂肪細胞也很重要。缺失C／EBPb或C／EBPd會損害白色脂肪的生成，而兩者共缺失，將產(chǎn)生更嚴重的影響。大約有80%的C／EBPb和C／EBPd共缺失小鼠會在出生后死掉，而部分能夠長至成年。但是有趣的是，盡管共缺失小鼠全身的脂肪量顯著減少，但PPARg、C／EBPa和aP2的表達正常，說明體內(nèi)存在其他的補償機制［17］。

C／EBPa在脂肪分化的晚期誘導表達，并且在成熟的脂肪細胞中含量豐富，C／EBPa對胰島素依賴的葡萄糖攝入也很關(guān)鍵。全基因組分析表明，細胞中存在上千個C／EBPa結(jié)合位點，并且大部分都與PPARg的結(jié)合位點共定位。在C／EBPa敲除的小鼠胚胎成纖維細胞 （mouse embryonic fibroblasts，MEF）中，異位過表達PPARg能夠拯救其脂肪分化能力，說明C／EBPa在脂肪細胞中并不是不可或缺的，C／EBP的其它成員可能在一定程度上能夠補償其功能［18］。事實上，C／EBPb與 C／EBPa有著相似的DNA結(jié)合特征，并且C／EBPb在成熟的脂肪細胞中保留有轉(zhuǎn)錄活性。共缺失C／EBPa和C／EBPb能夠顯著降低許多基因的表達，如aP2，脂聯(lián)素，激素敏感酯酶等。這些都說明，與PPARg類似，C／EBPs在轉(zhuǎn)錄調(diào)控脂肪細胞分化上具有關(guān)鍵的作用，但PPARg與C／EBPs的精確互作機制仍需進一步闡釋［19］。

2 Hedgehog信號通路

Hedgehog信號通路是動物發(fā)育的重要信號通路之一，其參與調(diào)節(jié)動物的胚胎發(fā)育、體節(jié)形成、脊索發(fā)育、大腦發(fā)育等重要過程［20－22］。哺乳動物存在三種hedgehog蛋白，SHH（sonic hedgehog），IHH（india hedgehog）和 DHH（desert hedgehog），其中SHH被研究的最為透徹。SHH在表達過程中，首先作為一種前體蛋白被表達出來，經(jīng)過蛋白水解和脂質(zhì)修飾后才成為成熟的有功能的蛋白。分泌的SHH會被一個含有12次跨膜區(qū)域的蛋白受體PTC（patched）所識別，PTC有兩個同源體，PTCH1和PTCH2，其中PTCH1起主要介導作用。SHH與PTC結(jié)合后，促使PTC其釋放一個關(guān)聯(lián)蛋白SMO（smoothened）。SMO 然后與 Glis（glioma－associated oncogenes）相結(jié)合誘導下游基因的表達。胞內(nèi)的Glis有三種類型，Gli1，Gli2和Gli3。其中Gli1和Gli2主要作為轉(zhuǎn)錄激活因子，而Gli3作為轉(zhuǎn)錄抑制因子。Glis下游的效應(yīng)基因包括Myf5等，Glis能通過Pax3／7以及 Myf5促進肌肉的發(fā)育［23，24］。

一直以來，Hegehog信號通路被認為僅在胚胎發(fā)育階段發(fā)揮作用，越來越多的證據(jù)表明，SHH信號通路在脂肪生成中也有重要的作用。肥胖能夠下調(diào)SHH信號通路的表達水平，包括SMO，Gli1，Gli2和Gli3［25］。激活SHH信號通路能夠抑制前脂肪細胞的分化，在誘導脂肪細胞分化時，降低SHH信號通路的表達水平是必要但非充分的條件。SHH信號通路能夠促進干細胞分化為成肌細胞或成骨細胞，而抑制SHH的表達則有助于脂肪細胞的分化。SHH信號通路與脂肪生成間的機制目前并不是非常的清楚。GATA2（GATA binding protein 2）可能一定程度上介導了SHH的抑制脂肪細胞分化功能。GATA2能夠與PPARg和CEBPa直接互作，進而抑制PPARg的促脂肪分化能力［9，26］。在抑制脂肪細胞分化的同時，GATA2能夠招募MEF2（myogenic enhancer factor－2）進而促進肌肉細胞的分化。SHH抑制脂肪細胞分化的另一個途徑可能由COUP－TFII（chicken ovalbumin upstream promoter－transcription factor II，COUP－TFII，也稱作Nr2f2）來介導［27］。表達SHH能夠誘導Nr2f2的表達，而Nr2f2能夠結(jié)合在PPARg和C／EBPa的啟動子區(qū)進而抑制他們的表達［28－30］。

3 Wnt／beta－catenin信號通路

Wnt是一種分泌性糖蛋白，對多種細胞類型和組織的發(fā)育有重要的調(diào)控作用［31］。經(jīng)典的 Wnt信號通路依賴于β－catenin，所以稱為 Wnt／β－catenin信號通路。Wnt與Frizzled蛋白的結(jié)合能夠激活DSH（disheveled）蛋白家族，然后進一步抑制一個包含axin，GSK－3β（glycogen synthesis kinase－3β）和APC（anaphase－promoting complex）的蛋白復合體，然后導致β－catenin的聚集［32］。如果沒有 Wnt的刺激，axin／GSK－3β／APC蛋白復合體就會通過磷酸化降解 β－catenin［33］。穩(wěn)定的β－catenin入核后會與TCF／LEF（T cell factor／Lymphoid enhancer factor）轉(zhuǎn)錄因子家族相結(jié)合，進而激活特異性的靶基因。因此β－catenin在Wnt信號通路中起到了至關(guān)重要的作用。在骨骼肌中，β－catenin能夠調(diào)節(jié)Pax3和Gli的表達，Pax3位于MyoD的上游在肌肉生成中具有重要作用，而Gli能夠誘導Myf5的表達［34，35］。在培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞中激活 Wnt信號通路能夠增加肌肉生成而抑制脂肪生成，阻斷 Wn t／β－catenin信號通路能夠抑制肌肉的生成［36］。

除了通過TCF／LEF轉(zhuǎn)錄因子誘導肌肉生成，β－catenin還能夠通過FOXO（forkhead transcription factors）共調(diào)控因子來發(fā)揮作用［37］。在哺乳動物細胞中，β－catenin能夠與FOXO相結(jié)合，進而增強其轉(zhuǎn)錄活性。炎癥和氧化應(yīng)激能夠增加FOXO的表達，從而導致部分正常情況下與TCF相結(jié)合的βcatenin現(xiàn)在與FOXO相結(jié)合［38］。另外Wnt／βcatenin也可以通過Nr2f2來調(diào)控脂肪生成，Wnt／βcatenin能夠激活Nr2f2的表達，進而招募SMRT共抑制復合體來抑制PPARg1和PPARg2的表達。

4 BMPs

骨形態(tài)蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）能夠調(diào)控多種細胞通路，例如細胞分化、增殖和凋亡。BMPs屬于 TGFβ（transforming growth factorβ）超家族。BMP信號通路的激活需要type I和type II兩類受體，兩類受體都包含絲氨酸／蘇氨酸激酶活性結(jié)構(gòu)域。與BMPs結(jié)合后，II型受體的激酶活性被激活，然后磷酸化I型受體，進而導致固有的絲氨酸／蘇氨酸激酶激活，進一步磷酸化Smad1，5，8。磷酸化的Smad1，5，8與Smad 4形成異源二聚體，然后遷移入核啟動下游基因表達。

在哺乳動物中目前共鑒定到了15種BMP蛋白，其中BMP－2和BMP－4能夠調(diào)節(jié)脂肪生成和骨生成，而 BMP－7 能夠促進棕色脂肪的生成［39］。BMPs對脂肪生成的調(diào)控作用具有劑量依賴性。在低劑量的時候能夠促進脂肪生成，但高劑量的時候能夠促進骨的生成。低水平的BMP－2，4能夠促進白色脂肪的生成，但BMP－7促進棕色脂肪的生成。BMP－2，4，7都能夠誘導胞內(nèi)脂滴的聚集和PPARg的表達，但只有BMP－7能夠促進 UCP－1的表達，UCP－1是棕色脂肪的標志基因，另外棕色脂肪的另一個關(guān)鍵調(diào)控因子PRDM16也能夠被BMP－7所誘導表達［39，40］。

BMP－2能夠通過Smad1和p38促進脂肪分化，Smad1，5，8更傾向于與富含GC的元件結(jié)合而不是Smad特異性元件（5＇－GTCTAGAC－3＇），一 般Smad2，3更傾向于與特異性元件結(jié)合［41］。因為Smad1，5，8沒有特異性的結(jié)合位點，所以共激活因子對于BMP特異性靶基因的選擇非常的重要。Shn（Schnurri）就是一個共激活因子，在脊椎動物中，Shn有三個同源類型，Shn－1，2，3。Shn－2敲除鼠表現(xiàn)出更低的脂肪沉積。在BMP－2的刺激下，Shn－2入核后與Smad1／4和C／EBPa形成復合體，誘導PPARg的表達。總體來說，BMP調(diào)控脂肪的途徑還不是非常的清晰，需要進一步的試驗研究來證明和闡釋。

5 KLFs

大量的證據(jù)表明 KLFs（Krupel－like factors）在脂肪分化過程中具有重要的作用，這類蛋白由一大家族鋅指轉(zhuǎn)錄因子組成，他們可以結(jié)合在CACCC和GC－rich的DNA片段上，因細胞或基因組的位置不同而起激活或抑制作用［42］，KLFs在脂肪分化中也有不同的作用。KLF4能夠在脂肪細胞分化的前24個小時瞬時表達，然后激活C／EBPb的表達，一般認為KLF4參與脂肪分化的早期程序。KLF4與另一個鋅指蛋白Krox20可以互作，Krox20也對脂肪分化有正向調(diào)控作用［43］。KLF6、KLF5 和KLF15也對脂肪細胞分化有促進作用。KLF6能夠結(jié)合在DLK1的啟動子區(qū)招募HDAC3進而抑制DLK1的轉(zhuǎn)錄。KLF5雜合子新生小鼠擁有更少的脂肪含量，更小的脂肪細胞和脂肪細胞特異性基因的表達下調(diào)，這都源于脂肪細胞分化缺陷。另外研究表明，KLF5與C／EBPb、C／EBPd有互作從而能夠參與早期脂肪細胞的分化。同樣，KLF15能夠在脂肪分化的后期與C／EBPa互作，激活PPARg的表達［44］。KLF2在前脂肪細胞中表達，能夠抑制PPARg的啟動活性，進而抑制脂肪細胞的分化。KLF3同樣也具有抑制脂肪細胞分化的作用，它發(fā)揮作用的機制可能是招募碳端結(jié)合蛋白（C－terminal binding protein，CtBP）共抑制因子進而抑制C／EBPa的表達。但是比較奇怪的是，KLF3敲除小鼠卻含有更少的脂肪塊和更小脂肪細胞體積和數(shù)量，需要有進一步的工作來闡釋KLFs家族在脂肪分化中的作用，以及他們與PPARg和C／EBPs的互作。

6 Insulin和IGF1

胰島素對于脂肪細胞分化有很顯著的影響。在脂肪細胞分化早期，胰島素主要通過胰島素生長因子1（insulin growth factor－1，IGF1）發(fā)揮作用，因為前體脂肪細胞表達更多的IGF1受體而不是Insulin受體，不過這個比例隨著分化的進行而發(fā)生改變。缺失胰島素受體的鼠成纖維細胞和棕色前體脂肪細胞會失去脂肪分化的能力，但是脂肪組織特異敲除胰島素受體的小鼠卻有脂肪組織的生成，這可能是因為用于啟動Cre重組酶表達的Fabp4啟動子直到脂肪細胞分化啟動以后才具有啟動活性所致。同時，IGF1受體可以在體內(nèi)能夠補償胰島素受體的缺失，但體外環(huán)境中卻不行［6］。胰島素／IGF1信號通路下游的因子對于脂肪分化也很重要。缺失某個胰島素受體底物（insulin－receptor substrate，IRS）蛋白會抑制脂肪生成，而且IRS的重要性依次為IR S1＞IRS3＞IRS2＞IRS4。在體外雙敲除IRS1和IRS2會阻止脂肪細胞分化，IRS1／IRS3雙敲除小鼠則表現(xiàn)明顯的脂肪萎縮，雖然棕色脂肪組織發(fā)育相對正常［45］。在胰島素信號通路的更下游，抑制磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol－3kinase，PI3K）以及缺失 AKT1／蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）或AKT2／PKB都會抑制脂肪生成。基因敲除AKT1和AKT2的小鼠會出現(xiàn)脂肪萎縮，而且這些小鼠的MSCs無法分化［46］。這個通路的重要性在人類研究得到證實，攜帶AKT2突變的家族成員會得脂肪萎縮性糖尿?。?7］。其他胰島素下游的效應(yīng)因子，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）被證明參與了脂肪細胞分化調(diào)控，最新研究表明mTOR同時還與動物的壽命密切相關(guān)［48］，進一步說明動物脂肪組織的代謝能夠影響機體的健康與壽命。

7 其他調(diào)控機制

除過這些被研究的相對透徹的調(diào)控因子與通路外，還有一些其他機制參與調(diào)控脂肪的分化生成，如組蛋白修飾［49］、miRNA、蛋白質(zhì)的泛素化修飾［50］、未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）［51，52］、氧化應(yīng)激［53］、細胞自噬［54］、晝夜節(jié)律［55］等，不過這些機制不如前面的研究透徹。

8 展望

脂肪組織作為一個能量儲存和分泌分泌器官，對于機體的能量平衡及生理調(diào)控具有重要的作用。脂肪沉積是一個包含脂肪細胞分化、甘油三酯合成與水解、脂肪細胞凋亡等內(nèi)容的復雜生物過程，其分子調(diào)控機制錯綜復雜，目前還需要更多的研究工作來解釋這個生物過程，例如繼續(xù)挖掘細化已知的調(diào)控通路，尋找新的信號通路及重要調(diào)控基因，鑒定這些已知的通路在脂肪生成中的相互作用等。闡釋脂肪沉積的分子調(diào)控機制，有助于我們理解脂肪代謝相關(guān)疾病的生物學基礎(chǔ)，從而為治療及預(yù)防這些疾病提供理論依據(jù)，同時由于目前關(guān)于脂肪生成的理論和知識大都來自于小鼠和人的研究，因此驗證這些信號通路在家畜上的調(diào)控機制，對于動物育種也具有重要的意義。

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