牛胚胎移植技術(shù)操作流程及應(yīng)用前景

豆曉麗，樊天喜

牛胚胎移植技術(shù)充分挖掘優(yōu)秀母畜的繁殖潛力，同時(shí)在加快遺傳進(jìn)展、增加肉用畜種的雙胎率、克服母畜不孕癥、降低引種費(fèi)用、減少疾病傳播等方面具有重要價(jià)值。牛的胚胎移植過程大致可分為以下幾個(gè)環(huán)節(jié)：同期發(fā)情→超數(shù)排卵→胚胎采集→胚胎檢測(cè)→胚胎保存→胚胎移植。只有嚴(yán)格把握各個(gè)操作環(huán)節(jié)技術(shù)要領(lǐng)，才能獲得滿意的結(jié)果。

1 同期發(fā)情

1.1 供體、受體母牛的選擇

1.1.1 供體母牛的選擇 供體應(yīng)是良種，而且性狀表現(xiàn)優(yōu)秀，具有較高育種價(jià)值與遺傳優(yōu)勢(shì)的個(gè)體，生產(chǎn)性能高、遺傳性穩(wěn)定、系譜清楚、體質(zhì)健壯、繁殖機(jī)能正常、無遺傳和傳染性疾病、年齡在2周歲到7周歲以內(nèi)、產(chǎn)犢在3個(gè)月以上，6個(gè)月以內(nèi)的母牛。必須嚴(yán)格掌握發(fā)情時(shí)間和前兩個(gè)發(fā)情周期，不能改變飼養(yǎng)環(huán)境條件，如長(zhǎng)途運(yùn)輸，飼養(yǎng)成分等。

1.1.2 受體母牛的選擇 受體牛僅作為借腹懷胎，不要求遺傳性狀，但發(fā)情周期必須正常，年齡在2周歲到5周歲以內(nèi)，健康狀況良好，不能有任何影響繁殖性能的疾病，尤其是生殖器官正常。

1.2 供、受體同期發(fā)情

要求受體和供體的發(fā)情時(shí)間要相同或相近，前后差異不超過1d，故對(duì)供、受體進(jìn)行同期發(fā)情處理。同期發(fā)情常用 PMSG、GnRH、FSH、LH、hCG、P4等［1］外源性激素對(duì)牛只進(jìn)行處理，達(dá)到發(fā)情和排卵的時(shí)間同期化的目的。目前，生產(chǎn)中常用的是氯前列烯醇（PGC），其溶黃體的生物活性相當(dāng)于PG的200倍，相當(dāng)于15－甲基前列腺素的10倍以上，由于其效果確實(shí)，價(jià)格低廉，使用方便，廣泛應(yīng)用于家畜同期發(fā)情，牛的用量一般為0.3mg［2］。

2 超數(shù)排卵

2.1 處理牛選擇

超排處理時(shí)選擇母牛上次發(fā)情周期9～12d進(jìn)行，發(fā)情時(shí)要注意跟蹤直腸檢查，確定黃體數(shù)、級(jí)別、卵泡數(shù)等，判斷黃體的位置及數(shù)量與卵泡的數(shù)量及位置是否一致。超排開始時(shí)要停止直腸檢查。超排時(shí)所用藥物劑量要因牛而異。對(duì)選擇好的供體牛于上次發(fā)情周期的9～12d開始超排處理。

2.2 超數(shù)排卵方法

將30mgFSH溶解于10mL30%PVP（聚乙烯吡咯酮）后，在供體牛發(fā)情后第9～13d一次性注射。朱華彬等指出，用30%的聚乙烯吡咯酮溶解后，F(xiàn)SH在牛體內(nèi)的半衰期為3d，因此可以一次肌肉注射給牛超排，既簡(jiǎn)化超排程序，又能提高超排效果［3］。

3 胚胎采集

供體受精日計(jì)0d，輸精第6d或第7d采集胚胎。首先將牛保定，保定架前高后低（相差20cm），然后用2%普魯卡因2～5mL在第一與第二尾椎間隙部位進(jìn)行尾椎硬膜外腔麻醉。麻醉后消毒外陰，用子宮擴(kuò)張棒擴(kuò)張子宮頸，清除宮頸粘液。采取二通管正壓沖卵［4］，即將插有內(nèi)芯的沖卵管插入一側(cè)子宮角，在達(dá)到子宮大彎時(shí)，助手協(xié)助拔出內(nèi)芯5～10cm，直到?jīng)_卵管達(dá)到子宮角首段為止，給二通管內(nèi)充氣10～20mL，最后拔出內(nèi)芯。操作者握住子宮輸卵管結(jié)合處，每次宮注液量依子宮大小而定，每側(cè)宮角沖洗6～7次。

4 胚胎檢測(cè)

檢查的過程中一般先將沖胚液靜置30min，然后放于實(shí)體顯微鏡下放大16倍尋找胚胎。根據(jù)平皿的形態(tài)可以從上到下，從左到右，從外到內(nèi)螺旋形依次移動(dòng)，將找到的卵用吸管吸出放入裝有PBS的保存液滴中，然后吸些PBS吹向卵周圍，使卵在液滴中翻騰，以便清除胚胎周圍的粘連物。將凈化后的胚胎置于PBS液中，然后放在40～200倍顯微鏡下作形態(tài)學(xué)檢查。研究證實(shí)，胚胎內(nèi)活細(xì)胞數(shù)的多少與之妊娠率成正比例。一般按質(zhì)量把胚胎分為A、B、C、D四個(gè)等級(jí)。胚胎與發(fā)育期相吻合，卵裂球輪廓清晰，透明度適中，細(xì)胞密度大，卵裂均勻，無水泡樣裂球，無變性細(xì)胞，即為優(yōu)秀胚，定為A級(jí)；與典型的胚胎相比，稍有變形，但卵細(xì)胞和分裂球的輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)較致密，分布均勻，變性細(xì)胞和水泡不超過10%～30%的定為B級(jí)；凡形態(tài)有明顯變異，卵細(xì)胞和分裂球輪廓稍不清晰，或部分不清晰，細(xì)胞質(zhì)不致密，分布不均勻，色調(diào)發(fā)暗，突出的細(xì)胞、水泡和變性細(xì)胞占30%～50%的胚胎定為C級(jí)；凡總體形態(tài)結(jié)構(gòu)不正常的卵子、未受精的退化或破碎卵子，透明帶空的或?qū)⒖盏穆炎樱约芭c正常胚胎相比，發(fā)育遲2d或2d以上的胚胎定為D級(jí)。

5 胚胎的保存

許多優(yōu)秀供體的胚胎常經(jīng)液氮冷凍保存多年。用于冷凍保存的胚胎是經(jīng)質(zhì)量鑒定的A、B級(jí)胚胎?，F(xiàn)有的牛胚胎冷凍方法有五種

5.1 傳統(tǒng)的冷凍法

具體步驟為①在室溫下，胚胎放入小分子滲透性冷凍保護(hù)劑中，如：乙二醇、甘油、DMSO或丙二醇中直到胚胎冷凍保護(hù)液達(dá)到平衡；②在－5℃到－7℃誘發(fā)結(jié)晶（植冰）；③以0.2℃～2.0℃／min速度冷凍；④在－35℃到－75℃時(shí)浸入LN2并保存在LN2中；⑤以大約250℃／min（如25℃靜止水?。┙鈨?；⑥在培養(yǎng)或轉(zhuǎn)移前室溫下脫冷凍劑。為確保冷凍胚胎存活率，嚴(yán)格按照冷凍程序進(jìn)行冷凍是非常重要的。

5.2 一步細(xì)管冷凍保存法之一（甘油冷凍劑）

Loibo，SP（1984）發(fā)明了牛胚胎一步細(xì)管冷凍保存法，方法為：將冷凍液（1.5mol／L甘油）和解凍液（0.5～1.0mol／L蔗糖）放在同一細(xì)管內(nèi)：兩種液體用氣柱分開，解凍時(shí)，輕輕搖動(dòng)細(xì)管使兩種液體混合，由于蔗糖是高滲溶液，使甘油從牛胚胎內(nèi)脫出。這種方法不需要顯微鏡觀察，直接把胚胎移入母畜體內(nèi)，胚胎進(jìn)入子宮后，通過吸收子宮水份而使其恢復(fù)到最初的等滲體積狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種方法受體牛妊娠率不穩(wěn)定。主要原因是：①在細(xì)管內(nèi)冷凍液和解凍液難以混合；②胚胎易粘在細(xì)管棉塞上造成丟失；③當(dāng)解凍溫度升高時(shí)，高濃度蔗糖對(duì)胚胎發(fā)育有害。

5.3 一步細(xì)管法冷凍保存法之二

考慮到甘油冷凍劑分子量高和對(duì)細(xì)胞膜通透性差的特點(diǎn)，Hernandez－Ledezma，JJ（1988）等提出使用高滲透性、低毒性的冷凍保護(hù)劑如乙二醇或丙二醇對(duì)一步細(xì)管法冷凍保存牛胚胎進(jìn)行了改進(jìn)，該方法為直接用1.4M乙二醇進(jìn)行牛胚胎冷凍，冷凍和解凍方法同傳統(tǒng)方法。不同之處，是解凍后將胚胎連同冷凍保護(hù)劑一起直接移植到母畜體內(nèi)，不需要搖動(dòng)細(xì)管使冷凍和解凍液混合（未有解凍液）。這種方法具有不需要特定的儀器設(shè)備、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，總的牛胚胎移植妊娠率接近傳統(tǒng)的冷凍保存方法。該冷凍是牛胚胎移植產(chǎn)業(yè)化最理想的方法之一。

5.4 快速冷凍

顧名思義，該方法主要加快了冷凍速度，由傳統(tǒng)冷凍法250℃／min提高到1 250℃／min，這樣使冷凍時(shí)間由過去的3h縮短到30min（Rayos，1992；Shaw，1991），使用方法是利用2～4.5mol／L滲透性冷凍保存液如甘油、乙二醇，DOSO或乙二醇與0.25～0.5mol／L滲透性冷凍保存液如蔗糖、海藻糖、半乳糖或乳糖混合物作為哺乳動(dòng)物胚胎冷凍保存液，平衡30s到3min后，處于部分脫水胚胎放入液氮蒸氣中冷凍后浸入LN2中。在快速冷凍過程中，細(xì)胞外水份被冷凍，同時(shí)提高冷凍液的滲透壓，促使細(xì)胞水份進(jìn)一步滲出。利用此法冷凍胚胎，細(xì)胞內(nèi)有可能形成冰晶。在解凍過程中如果解凍速度不當(dāng)會(huì)造成胚胎損傷，牛胚胎快速冷凍后存活率為33.3%，低于傳統(tǒng)的快速冷凍法和玻璃化冷凍方法（Niemann H，1986）［5］。

5.5 玻璃化冷凍法

是近年來發(fā)展起來的一種新的方法。將胚胎在適當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo(hù)劑混合液中作短暫處理后，直接投入液氮。冷凍保護(hù)劑在急劇降溫到很低溫度時(shí)能被濃縮而不結(jié)晶，而且液體的粘性增強(qiáng)，由液態(tài)變?yōu)橥该鞯墓虘B(tài)，形成玻璃化。用這種方法冷凍，無需凍前分步添加抗凍劑和凍后分步脫除抗凍劑的繁瑣步驟，簡(jiǎn)化了冷凍過程，是一種簡(jiǎn)便、快速、有效的冷凍方法，不需要冷凍儀器。

6 胚胎移植

6.1 受體牛的準(zhǔn)備

要求受體牛發(fā)情時(shí)直腸檢查的卵泡直徑在10～20mm左右，發(fā)情后36h出現(xiàn)排卵。移植前檢查黃體，其直徑在11～15mm以上，黃體的手感性好，質(zhì)地軟而充實(shí)。

6.2 受體牛處理

用2%普魯卡因2～5mL實(shí)施1～2尾椎間隙硬膜外腔麻醉，系尾，清洗外陰，用高錳酸鉀水沖洗消毒，用滅菌紙擦干，最后用酒精棉球消毒。

6.3 胚胎選擇

根據(jù)受體牛的發(fā)情天數(shù)選擇不同胚齡的胚胎。一般將致密桑椹胚、早期囊胚和囊胚分別移植給發(fā)情6d、7d、8d的發(fā)情母牛。

6.4 移植

胚胎移植時(shí)可用0.25mL吸管分三段吸入PBS保存液，中間由兩個(gè)氣泡隔開，中段含有胚胎［6］。剪去封口端，輕輕甩向棉塞端，裝槍，把移植槍推入黃體一側(cè)的子宮角，并使其深入到子宮角的大彎部，持移植槍的右手推出胚胎，緩慢旋轉(zhuǎn)地抽出移植槍。

7 受體牛妊娠

在移植后第12～15d觀察受體牛發(fā)情返情情況。若牛出現(xiàn)返情，則表明移植失??；如未發(fā)情，繼續(xù)觀察3～5個(gè)情期，并在適宜時(shí)期進(jìn)行妊娠診斷，通常用直腸檢查法在移植3個(gè)月時(shí)檢查。在妊娠90 d時(shí)，子宮繼續(xù)增大，落入腹腔，可感覺胎兒的浮動(dòng)，孕角出現(xiàn)孕脈，有時(shí)可觸摸到子葉［7］。

8 技術(shù)應(yīng)用存在的問題和應(yīng)用前景

8.1 存在的問題

我國(guó)胚胎移植技術(shù)起步較晚，目前牛胚胎移植技術(shù)在推廣在中還存在一些問題：①是專業(yè)技術(shù)人員缺乏，因?yàn)樵诓僮鬟^程中，大部分環(huán)節(jié)要靠操作者嫻熟的操作技能把握分寸，確定最佳時(shí)機(jī)、最佳位置，以取得最佳效果；②是胚胎移植費(fèi)用較高，限制了它的大量推廣；③是純種動(dòng)物胚胎來源主要靠超排，由于無法完全掌握其規(guī)律，還不能預(yù)測(cè)超排結(jié)果，不同個(gè)體對(duì)超排處理的反應(yīng)差異較大，排卵率不夠穩(wěn)定；④是胚胎回收率低，通常在50%～80%；⑤是移植成功率低，現(xiàn)世界范圍內(nèi)胚胎成功率多在50%～60%［8］。

8.2 應(yīng)用前景

因?yàn)榕５慕?jīng)濟(jì)價(jià)值高、單胎、繁殖周期長(zhǎng)、常年發(fā)情，所以采取胚胎移植技術(shù)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶牛、肉牛，是一條多、快、好、省的路子，它既是科學(xué)技術(shù)的增長(zhǎng)點(diǎn)，也是經(jīng)濟(jì)發(fā)展的增長(zhǎng)點(diǎn)，具有廣泛發(fā)展空間和持續(xù)發(fā)展前景。今后隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展更新，牛胚胎移植將在品種改良、乳業(yè)發(fā)展和胚胎工程、基因工程、干細(xì)胞研究等方面發(fā)揮越來越大的作用。

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