肉牛凍精細管無傷害制作技術(shù)

林 清，田萬強，雷初朝，曹 暉，湯懷斌，昝林森，陳 宏＊

1 種公牛飼養(yǎng)管理

公牛是養(yǎng)在牛舍的單間，還有一個32m2的運動場。牛舍建得較高，上面有氣流通道，下層有通風口，牛床保持柔軟墊草30cm，并保持干燥，這樣可使舍內(nèi)小氣候冬暖夏涼。冬季，密閉的牛舍可通過排氣孔換氣。成年采精公牛一般不需飼養(yǎng)人員牽引運動。用電動轉(zhuǎn)盤每天運動一次，每次1h，以保證使用后能順利采精。

通過全價飼養(yǎng)控制公牛膘情，以生產(chǎn)出活力好的精液成年公牛每天喂干草13kg、精料3kg、大蒜風干片30g、含蒜20% 的大蒜草粉100g、礦物質(zhì)添加劑50g、海藻粉100g。

每千克公牛用礦物質(zhì)添加劑含維生素A、D330萬和60萬國際單位，維生素E、K3、B1分別為200、150、300mg。酵母50g、海藻100g、食鹽50g、鎂6.03g。鐵2.01g、鋅1.14g、錳1.06g、銅0.51g、鉆24mg、磷19.98g，鈣287.87g。

保持種公牛健康無病，每年經(jīng)過兩次檢疫達到合格標準。每天保證運動量在2h以上。采精期間每天補充雞蛋5～8個，紅蘿卜500g以上。采精頻度以每周2次為宜，每次采精時間間隔30min為宜。

2 采精及凍精細管制作

2.1 采精前的準備

2.1.1 公牛和胎畜 提前準備好采精胎畜（以發(fā)青母牛為好），清理胎畜后軀污物。種公牛采精前用消毒液清洗下身污物。剪去包皮周圍長毛。使這一區(qū)域保持干凈無污染。

2.1.2 采精設(shè)備的清洗和消毒 采精設(shè)備中凡是與精液直接接觸的內(nèi)胎（光面）、積精管、溫度計、玻璃棒、鑷子等先用清水加清洗劑清洗干凈，再用蒸餾水清洗三遍，以內(nèi)胎上面不掛水珠，并有一層水膜均勻附著在上面為好。清洗干凈后晾干，然后再用75%酒精棉球整體擦洗三遍，注意不要有遺漏地方。這項工作需要在采精前12h完成。

2.1.3 采精設(shè)備安裝 安裝人員在安裝前簡短指甲，并磨光。然后清洗手臂，再用75%酒精棉球消毒手臂。最后再安裝采精器。注意安裝內(nèi)胎以平滑無皺褶為好。

2.1.4 采精場地 采精場地保持干凈衛(wèi)生，必要時場地每周消毒一次。采精輔助人員保持自身安全，保持采精場地、安靜、干凈，采精過程中不要大聲喧嘩。

2.2 采精過程

采精人員在胎畜和種公牛到位后，需在盡短時間內(nèi)調(diào)整好采精器溫度38～42℃。潤滑劑（凡士林）以內(nèi)胎前1／3～1／2均勻涂抹，不宜過多。壓力保持適中。等種公牛爬跨后迅速將公牛陰莖導(dǎo)入假陰道內(nèi)。等公牛射精后，應(yīng)多停留幾秒時間等精液完全流進積精瓶，切勿立刻退出。注意一定要使積精管內(nèi)溫度保持在35℃。

2.3 采精后檢查

檢查采精量，檢查活力、密度、pH值等各項指標，并及時做好記錄。

2.4 稀釋液的配制

在采精的同時制備稀釋液配方：基液：乳糖2.5 g、檸檬酸鈉1.4g、葡萄糖1.2g、果糖0.5g，以上各物溶于100mL蒸餾水（雙蒸水）中，充分混合均勻。然后高壓滅菌15min。

A液：基液80mL＋20mL新鮮卵黃，再加青霉素16萬單位 鏈霉素10萬單位，然后采用磁力攪拌器攪拌，攪拌時間至少20min，混合均勻。

B液：A液93mL＋7mL甘油，混合均勻。

2.5 稀釋過程

第一次稀釋：按照檢查結(jié)果確定稀釋倍數(shù)，原精液與A液緩慢稀釋，并均勻混合，稀釋到最后稀釋倍數(shù)的一半。這一過程可以在36℃條件下進行。

由36℃條件轉(zhuǎn)入4℃條件也需要緩慢進行。這一過程需要1.5h以上。

第二次稀釋：按照檢查結(jié)果確定稀釋倍數(shù)，第一次稀釋后的精液與B液緩慢滴注，稀釋到最后稀釋倍數(shù)。

2.6 平衡過程

使稀釋后的精液溫度保持4～5℃環(huán)境下，平衡2～4h。然后再次活力檢查。

2.7 分裝和封口

平衡后符合質(zhì)量的精液在2～4h內(nèi)進行分裝，每支細管0.25mL。保持封口端精液距離細管末端1cm為宜。再用長柄鑷子在酒精燈上適度考熱封口。這一過程在4℃條件下進行。

2.8 冷凍過程

熏蒸法：將分裝好的細管平鋪在自制的網(wǎng)篩上，立即擱置在盛液氮容的泡沫箱內(nèi)，加蓋進行熏蒸，初凍溫度在－100～－130℃ 之間，熏蒸7～8min，然后降溫至－160℃ ，再熏蒸4～5min。最后收集在細管袋中，液氮保存。注意標記種公牛號，制作時間，解凍方法等。

2.9 保存和檢查

制作好的細管凍精可長期保存在液氮灌內(nèi)，定期檢查并及時加注液氮，20d或一個月抽樣檢查一次凍精活力。如有質(zhì)量問題及時查找原因，并及時糾正。

3 活力檢查

3.1 細管凍精生產(chǎn)的質(zhì)量標準

1）解凍后精子活力不低于0.3（十級評定法）。

2）每支細管的精子數(shù)量不低于1 500萬個。

3）解凍后精子畸形率不高于2%。

4）解凍后精子存活時間在37℃下不低于4 h。

3.2 解凍及檢查

用36℃溫水快速解凍進行3～5s，并不停搖動。精液質(zhì)量檢查項目為活力、畸形精子率、存活時間。隨機抽樣5支，按最佳溫區(qū)解凍后，涂片放在保溫38℃顯微鏡下觀察?；盍υ?.3～0.65為合格，0.3以下為不合格。我們對制作的325支細管凍精進行了活力檢查，平均活力達到0.6以上。

3.3 活力檢測結(jié)果

我們對這種方法制作的1 200支細管凍精進行了50支抽檢，活力均在0.4～0.5之間。說明這種方法在實踐中是切實可行的，尤其對凍精活力有較大提高。