補(bǔ)腎活血對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮原代細(xì)胞NO表達(dá)的影響1）

劉中勇，李 林，方 家，陳寧南，鄧 鵬，方險(xiǎn)峰，鄒國(guó)輝

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為婦女在絕經(jīng)后機(jī)體開始向老年過(guò)渡。此時(shí)腎氣漸衰、天癸漸竭，女子以血為用，因數(shù)脫于血，且精血同源，故絕經(jīng)后相關(guān)疾病以腎陰虛者多見[1，2]。在更年期綜合征中醫(yī)研究中，本病大多被認(rèn)為屬腎陰虧虛[3，4]。中醫(yī)證型與性激素相關(guān)性研究也表明，促卵泡生成激素（FSH）、促黃體生成素（LH）升高，雌二醇（E2）下降，血清中NO水平明顯降低均為腎陰虛型[5，6]。腎為先天之本，通過(guò)其“藏精化血”，“主骨生髓、髓生血”的功能直接參與氣血活動(dòng)，由于腎與血在生理上關(guān)系密切，因此，在病理上近代有關(guān)“腎虛血瘀”的論述頗多，認(rèn)為腎虛必兼血瘀。“腎虛血瘀”也是婦女發(fā)生絕經(jīng)后冠心?。╟oronary heart disease，CHD）的主要病機(jī)[7，8]。應(yīng)用原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為載體，加入eNOS抑制劑L－NAME處理細(xì)胞，制備NO低表達(dá)細(xì)胞模型，觀察補(bǔ)腎活血方劑對(duì)原代細(xì)胞NO分泌的提高作用。

1 材料與方法

1.1 材料 標(biāo)本采自江西中醫(yī)藥大學(xué)婦產(chǎn)科正常分娩的新生兒臍帶。健康孕婦剖宮產(chǎn)后，無(wú)菌條件下剪取臍帶20cm，浸泡在磷酸鹽緩沖液中。立即對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.2 儀器及試劑 DMEM培養(yǎng)基GIBCO公司，0.25%胰酶（廣州杏海生物，Ginbio），Ⅷ抗體（武漢博士德），I型膠原酶（sigma公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記熒光二抗（武漢博士德），胎牛血清（杭州四季青），青鏈霉素雙抗（廣州杏海生物，Ginbio），NO檢測(cè)試劑盒（上海碧云天），倒置顯微鏡（NIKO），熒光顯微鏡 （Leica），超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈），酶標(biāo)儀（BIOTEK）。

1.3 樣品采集 取剖宮產(chǎn)新生兒臍帶，注入NaCl至靜脈另一端流出液體透明為止。把37℃預(yù)熱的0.1%Ⅰ型膠原酶注入臍靜脈至下端溶液流出，用止血鉗夾閉下端靜脈，繼續(xù)向靜脈內(nèi)注入膠原酶，用另一個(gè)止血鉗夾閉靜脈上端，將臍帶放入37℃CO2孵育箱中消15min。消化完畢后，松開臍帶兩端止血鉗，收集靜脈沖洗液，1 000r／min離心5min，棄上清。細(xì)胞重懸于RMPI1640培養(yǎng)液中，13%胎牛血清，置37℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。隔2d～4d更換1次培養(yǎng)基直至長(zhǎng)成單層細(xì)胞。原代細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%以上，用0.25%胰酶消化2min，1∶2傳代。

1.4 細(xì)胞因子Ⅷ免疫熒光染色 以每孔2×104／mL細(xì)胞密度接種24孔培養(yǎng)板做細(xì)胞爬片，培養(yǎng)24h，PBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15min，－20℃預(yù)冷甲醇通透10min，5%羊血清室溫封閉1h，加小鼠抗人Ⅷ單抗（空白對(duì)照用PBS替代），4℃過(guò)夜。PBS洗3×5min，生物素山羊抗小鼠二抗室溫反應(yīng)30 min，PBS洗3×5min。DAPI染色5min，熒光顯微鏡觀察。

1.5 藥物處理 補(bǔ)腎活血方：熟地黃20g，山萸12g，山藥12 g，澤瀉9g，丹皮9g，茯苓9g，丹參15g，水蛭3g。煎煮過(guò)濾除菌，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 含藥血清制備 選用日本純種大白兔二只，其中一只分別每日分2次給予補(bǔ)腎活血方總量15g／kg；另一對(duì)照組每日給予等量溫開水（15mL），灌胃10d后，于取血前12h、6h、3h、1h再各灌胃1次，并于取血前24h禁食（不禁水），心臟采血，取血后無(wú)菌分離血清，經(jīng)56℃、30min滅活處理后，用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 濃度血清制備 對(duì)照組：將15mL正常兔血清、5mL新生牛血清加入80mLRPMI1640液至100mL；不同濃度含藥血清（即20%、10%、5%）：將20mL、10mL、5mL含丹地劑血清分別加入至每瓶有5mL新生牛血清、75mLRPMI1640液中，后兩組分別再補(bǔ)充正常兔血清15mL、20mL，使三組總量分別至100mL。

E2組：將17β－雌二醇用 RPMI1640液配成0.01μmol／L?？瞻捉M為不含兔血清，單純?yōu)榕囵B(yǎng)液。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪種六孔板，每孔5×105細(xì)胞，每組3復(fù)孔。加eNOS抑制劑L－NAME按照10－6mol／L加入除空白組外所有組，預(yù)孵育1h加入不同劑量含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)至24h收集上清液檢測(cè)NO含量，提取蛋白質(zhì)做Western blot檢測(cè)。

1.8 細(xì)胞上清液中NO濃度測(cè)定 取出Griess ReagentⅠ和Ⅱ，使恢復(fù)室溫 ，取細(xì)胞上清液或者標(biāo)準(zhǔn)品50μL加試劑Ⅰ和試劑Ⅱ各50μL。酶標(biāo)儀540nm檢測(cè)吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.9 Western blot檢測(cè)蛋白eNOS蛋白表達(dá) 0.01mol／LPBS洗滌細(xì)胞兩次，每孔加入100μL RIPA裂解液，置冰上裂解20 min后，用干凈的細(xì)胞刮刷將細(xì)胞刮于孔的一側(cè)，然后用移液器將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5mL離心管中，4℃，12 000r／min離心5min，取上清。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)。剩余樣品按比例加入5Xloading buffer，煮沸10min，分裝后－20℃保存。每個(gè)樣品取30μg置于10%SDS－PAGE凝膠上電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下用5% 脫脂奶粉封閉1h。eNOS抗體以封閉液按照1∶500的比例稀釋，與PVDF膜一起封閉在雜交袋中4℃過(guò)夜后，與1∶6 000稀釋的羊抗兔IgG，室溫孵育1h。用SuperECL Plus超敏發(fā)光液按試劑說(shuō)明要求顯影、曝光。用Quantity one分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化。目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDH（1∶1 000）的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果即為樣品中eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 15.0軟件包分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞分離 用1%I型膠原酶消化20cm長(zhǎng)臍帶所收獲的內(nèi)皮細(xì)胞，接種于6cm培養(yǎng)皿，密度為105／mL～106／mL。接種4h后細(xì)胞開始貼壁，12h后大部分貼壁，24h后即可第一次換液除去未貼壁的紅細(xì)胞。早期的內(nèi)皮細(xì)胞多呈小多角形、球形、短梭形，細(xì)胞單層生長(zhǎng)，互不重疊。當(dāng)原代細(xì)胞接種密度達(dá)到105／mL～106／mL時(shí)，在接種48h～72h生長(zhǎng)最旺盛，4d～5 d即可融合。融合后的HUVEC為扁平多角形，呈典型的鵝卵石或鋪路石樣排列。細(xì)胞胞核清晰，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)稀疏空亮，核仁1～2個(gè)。免疫熒光顯示，細(xì)胞與FITC標(biāo)記的Ⅷ蛋白結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈綠色熒光，表明細(xì)胞表達(dá)Ⅷ蛋白，DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色。

2.2 細(xì)胞上清液中NO濃度 eNOS抑制劑與藥物處理細(xì)胞24h后。NC組（只加L－NAME）與空白組比較，NO含量明顯減少（5.64μmol／L±0.12μmol／L，P＜0.05）。陽(yáng)性對(duì)照藥物雌二醇處理組明顯升高NO含量（13.52μmol／L±0.19μmol／L）。藥物處理組提高內(nèi)皮細(xì)胞被L－NAME抑制的NO分泌。20%、10%、5%含藥血清處理 NO含量分別為（11.51μmol／L±0.68μmol／L，P＜0.05），（10.45μmol／L±0.36μmol／L，P＜0.05），（7.50μmol／L±0.45μmol／L，P＞0.05）。

3 討 論

正常的內(nèi)皮功能對(duì)于血管壁具有重要的保護(hù)作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化及許多疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)[9]。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后發(fā)生的功能改變則是導(dǎo)致心血管疾?。ㄈ绺哐獕?、心衰、冠心病、術(shù)后再狹窄、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓等）發(fā)生發(fā)展的重要因素，同時(shí)也參與腎病、糖尿病等一些難治性疾病[10]。血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的NO不僅可以調(diào)節(jié)血管平滑肌張力，也能抑制血小板聚集、白細(xì)胞黏附以及平滑肌細(xì)胞增殖，還可以減輕氧自由基造成的血管內(nèi)皮功能障礙[11]，被認(rèn)為是一種“內(nèi)源性的抗動(dòng)脈粥樣硬化分子”[12]。NO是由NOS催化L－精氨酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，NOS是其生物合成的關(guān)鍵限速酶。NO生成減少是血管內(nèi)皮功能不全的一個(gè)重要特征[13]。以血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙為共同特點(diǎn)的糖尿病、腦梗死、冠心病及高血壓等疾病患者，其血清NO水平明顯降低[14]。大量實(shí)驗(yàn)證明，雌激素作用于內(nèi)皮細(xì)胞后，一氧化氮合酶（eNOS）的數(shù)量上調(diào)[15]。雌激素的心血管保護(hù)作用與一氧化氮有關(guān)。成功分離培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察補(bǔ)腎活血方的研究表明，補(bǔ)腎活血方對(duì)更年期綜合征具有良好效果，對(duì)絕經(jīng)女性血脂構(gòu)成有正性作用。

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