中毒患者血液中普羅帕酮LC-MS/MS檢測(cè)方法的建立

孫成文，李嘉琳，王玉江，徐水英，孫愛(ài)麗，趙玉婧，邱澤武

中毒患者血液中普羅帕酮LC-MS/MS檢測(cè)方法的建立

孫成文，李嘉琳，王玉江，徐水英，孫愛(ài)麗，趙玉婧，邱澤武

目的：建立人血液普羅帕酮LC-MS/MS檢測(cè)方法，用于普羅帕酮中毒患者的診斷。方法：取患者靜脈全血，分離血清500μl，加1000μl乙腈混勻，離心沉淀，上清液用針頭濾器過(guò)濾，取10μl進(jìn)樣。在串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜電噴霧電離（ESI）正離子電離模式下，監(jiān)測(cè)m/z342.2/116.1和342.2/324.2兩對(duì)多反應(yīng)離子（MRM）進(jìn)行普羅帕酮檢測(cè)。分析保留時(shí)間（RT），確定線性范圍，計(jì)算檢出限、精密度和穩(wěn)定性。結(jié)果：普羅帕酮保留時(shí)間為5.08min，在1～1000 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r= 0.9984），最低定量限（LOQ）為0.1ng/mL，日內(nèi)精密度RSD為3.9%，日間精密度RSD為6.0%，平均回收率為96.5%，普羅帕酮在室溫環(huán)境中較為穩(wěn)定。結(jié)論：建立LC-MS/MS檢測(cè)普羅帕酮的方法靈敏、快速，特異性好，適用于普羅帕酮中毒患者的診斷與指導(dǎo)治療。

普羅帕酮；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；血液分析；中毒

普羅帕酮，為高效膜抑制性抗心律失常藥。具有膜穩(wěn)定作用及競(jìng)爭(zhēng)性β阻滯作用。能降低心肌興奮性，延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程及有效不應(yīng)期。臨床可用于治療室性和室上性異位搏動(dòng)，心動(dòng)過(guò)速，預(yù)激綜合征等疾病。近年來(lái)，臨床常見(jiàn)誤服或過(guò)量服用普羅帕酮導(dǎo)致中毒的現(xiàn)象，患者出現(xiàn)低血壓，心動(dòng)過(guò)緩，傳導(dǎo)阻滯等，嚴(yán)重者還會(huì)發(fā)生昏迷、抽搐、重度心律失常甚至死亡[1-2]。檢測(cè)血液中普羅帕酮濃度可以協(xié)助臨床中毒患者的診斷與治療。國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)血液普羅帕酮的液相色譜檢測(cè)方法，但多是從藥代動(dòng)力學(xué)和正常血藥濃度監(jiān)測(cè)的角度研究的，不適合臨床普羅帕酮中毒患者的搶救需要[3-5]。液相色譜-質(zhì)譜法具有靈敏度高和選擇性好等特點(diǎn)，本文利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）建立了一種較適合于中毒患者血液普羅帕酮的快速檢測(cè)方法。

1 資料和方法

1.1 儀器 超快速液相色譜儀（Prominence UFLC，LC-20AD，日本島津有限公司）、AB SCIEX三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（API3200，LC-MS/MS，配有電噴霧離子源和大氣壓化學(xué)源，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、Mil l iQ超純水器（美國(guó)Mi l l ipore公司）、萬(wàn)分之一電子分析天平（AG285，瑞士Met t ler-Toledo）、離心機(jī)（LG20-W，北京立離心機(jī)有限公司）。

1.2 試劑 鹽酸普羅帕酮（99.9%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；用1∶1甲醇（HPLC級(jí)，F(xiàn)isher Scienti f ic公司）水配制1mg/ml普羅帕酮溶液儲(chǔ)存4℃?zhèn)溆?；乙腈（HPLC級(jí)，F(xiàn)isher Scienti f ic公司）；甲酸（分析純，DIMA公司）；乙酸銨（分析純，DIMA公司）；液氮（≥99.9%，北京東方醫(yī)用氣體公司）；純水（18.2MΩ，Mil l iQ超純水器所制）；10份健康人混合血清（解放軍307醫(yī)院輸血科）。

1.3 配制標(biāo)準(zhǔn)曲線與質(zhì)控樣本 取1mg/mL普羅帕酮儲(chǔ)存液，分別配制1.0 ng/ml、10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml、1000.0 ng/ml濃度的血清樣品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml三個(gè)濃度觀察回收率、精密度、穩(wěn)定性等方法學(xué)指標(biāo)。

1.4 樣品前處理 取患者靜脈血液，離心分離血清500μl，加乙腈1000μl，振蕩器震蕩1 min。18 000 rpm高速離心（20 979 g），取上清液1000μl 0.22μm濾膜針頭濾器過(guò)濾到樣品瓶，10μl上機(jī)進(jìn)樣。

1.5 儀器分析條件

1.5.1液相色譜條件 色譜柱（Shim-pack XR-ODS 100Lx3.0色譜柱 島津公司），柱溫箱溫度40℃，10μl進(jìn)樣；流動(dòng)相：A相（5%甲醇水溶液+2mmol乙酸銨+1‰甲酸），B相（95%甲醇水溶液+2mmol乙酸銨+1‰甲酸），分析時(shí)間及A、B兩流動(dòng)相流率變化。見(jiàn)表1。

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧電離（ESI），ESI正離子電離模式下，監(jiān)測(cè)m/z 342.2/116.1和342.2/324.2兩對(duì)多反應(yīng)離子（MRM）；離子源霧化溫度：450℃；氣簾氣（CUR）10 psi，霧化氣（NEB） 50 psi，碰撞氣（CAD）5psi，電噴霧電壓（IS）4500V，采用MRM模式進(jìn)行正離子檢測(cè)。

1.6 定性與定量檢測(cè) 在同等條件下比對(duì)色譜峰的保留時(shí)間及兩對(duì)定性離子的相對(duì)豐度與普羅帕酮標(biāo)準(zhǔn)品一致，則可判定為普羅帕酮。定量采用外標(biāo)法。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜監(jiān)測(cè)離子的選擇 在ESI正離子模式下，用濃度1000 ng/ml的普羅帕酮溶液以針泵10.0μl/min的速度連續(xù)進(jìn)樣質(zhì)譜儀進(jìn)行全掃描，獲得普羅帕酮的[M+H]342.2準(zhǔn)分子離子峰，以其作為母離子進(jìn)行轟擊，獲得普羅帕酮二級(jí)全掃描質(zhì)譜。見(jiàn)圖1。選擇信號(hào)較強(qiáng)、分子量較大的m/z 342.2/116.1和342.2/324.2兩對(duì)離子在MRM模式下，進(jìn)一步優(yōu)化兩對(duì)監(jiān)測(cè)離子去簇電壓（DP）、射入電壓（EP）、碰撞能（CE）和碰撞池出口電壓（CXP）等參數(shù)。見(jiàn)表2。

2.2 保留時(shí)間及特異性 分別取空白血清和100 ng/ml的血清樣品500μl按“1.4”項(xiàng)處理上機(jī)進(jìn)樣10μl，普羅帕酮的保留時(shí)間為5.08min，未發(fā)現(xiàn)人血液樣品本底對(duì)普羅帕酮有干擾。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限 取1.0ng/ml、10.0ng/ml、100.0ng/ml、500.0ng/ml、1000.0ng/ml 5個(gè)濃度的普羅帕酮血清樣品建立曲線。以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得線性方程為Y＝1.49× 103X＋1.82×103，r=0.9984。選擇 m/z 342.2/ 116.1定量普羅帕酮，方法檢定量檢出限（LOQ）為0.1 ng/ml（信噪比S/N=10）。

2.4 回 收 率 取 10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml 3個(gè)濃度普羅帕酮血清樣品按“1.4”項(xiàng)處理，觀察普羅帕酮的回收率，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。結(jié)果10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml 3個(gè)濃度的平均回收率分別為98.3%、96.0%和95.2%，RSD分別為4.8%，4.2%，5.0%。

2.5 日內(nèi)與日間精密度 取10.0ng/ml、100.0ng/ml、500.0 ng/ml 3個(gè)濃度普羅帕酮樣品觀察精密度。于第1天內(nèi)測(cè)定3個(gè)樣品6次，計(jì)算日內(nèi)精密度RSD分別為5.1%，3.5%，3.0%；另分別將這3個(gè)樣品于第6天內(nèi)連續(xù)測(cè)定，測(cè)得3個(gè)濃度日間精密度RSD分別為7.5%，4.2%，6.4%。

2.6 穩(wěn) 定 性 將 10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml 3個(gè)濃度的血清樣品放置室溫觀察普羅帕酮在血清中的穩(wěn)定性。分別于4 h、8 h、24 h測(cè)定普羅帕酮濃度，3個(gè)樣品每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均進(jìn)樣6次，結(jié)果濃度沒(méi)有明顯變化。見(jiàn)表3。表明室溫條件下普羅帕酮在血清中穩(wěn)定性較好。

3 討論

普羅帕酮又稱心律平，化學(xué)名為丙胺苯丙酮，結(jié)構(gòu)中含有電負(fù)性較強(qiáng)的氮元素。見(jiàn)圖2。本文在ESI正離子模式下，對(duì)普羅帕酮進(jìn)行Q1和MS2掃描，均獲得了較強(qiáng)的信號(hào)響應(yīng)，為選擇LC-MS/MS-ESI正離子模式檢測(cè)普羅帕酮提供了基礎(chǔ)；在本方法中，采用“血液0.5ml+乙腈1ml，離心、過(guò)濾、上機(jī)進(jìn)樣”的普羅帕酮提取方法，步驟簡(jiǎn)短，可大大地縮短檢測(cè)時(shí)間。平均回收率達(dá)到96.5%，完全可以滿足臨床中毒患者的搶救需要。由于中毒患者有可能服用多種藥物，患者血液中還可能會(huì)有治療用藥，成分較為復(fù)雜。所以，在色譜條件中，我們選擇了一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的流動(dòng)相和梯度洗脫條件，主要目的是為了使樣品中的目標(biāo)化合物均得到較好的分離，以增加檢測(cè)的準(zhǔn)確性；因?yàn)楸驹囼?yàn)所涉及對(duì)象大多為中毒患者，因此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)選擇了較寬的濃度范圍，以便能盡量涵蓋重度中毒患者的高血藥濃度。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線r值大于0.99，相關(guān)性較好。如果患者中毒病情較重，普羅帕酮血液濃度較高，超出本方法的線性范圍，可對(duì)患者血清進(jìn)行10倍稀釋，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。近年來(lái)，利用本方法檢測(cè)了11例普羅帕酮過(guò)量的患者，男3例，女8例，年齡19～47歲。11例患者血液普羅帕酮濃度范圍為1530～4920 ng/ml，取得了良好效果。

[1]呂方方，李國(guó)強(qiáng)，楊 波.普羅帕酮急性中毒致心律失常和呼吸衰竭1例[J].藥物不良反應(yīng)雜志，2011，5（13）：301-302.

[2]孫宏杰，吳 旭，官大威，等.普羅帕酮中毒死亡1例[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2010，6（26）：475-476.

[3]董軍亞，張繼紅，焦曉紅，等.高效液相色譜法測(cè)定人血清中普羅帕酮的濃度[J].武警醫(yī)學(xué)，2006，6（17）：427-429.

[4]李東升，張才麗.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定兔血清中普羅帕酮和奎尼丁的濃度[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，2（10）：238-239.

[5]陳 鷹，裘 軍，吳 梅，等.反相高效液相色譜法選擇性測(cè)定血漿中普羅帕酮對(duì)映體[J].中國(guó)藥師，2000，1（3）：36-37.

（收稿：2013-05-27 修回：2013-06-17 編校：齊 彤）

Foundation of the HPLC-MS/MSmethod to analyze propafenone in blood of poisoned patients

SUN Cheng-wen,LIJia-lin,WANG Yu-jiang,XU Shui-ying，SUN Ai-li，ZHAO Yu-jing，QIU Ze-wu.The 307Hospitalof PLA,Beijing 100071,China

Objective：To establish a HPLC-MS/MSmethod for the testof propafenone in human blood,and diagnose the poisoning patients.Methods：500μl serum divided from venous blood wasmixed w ith 1000μl acetonitrile.After centrifugation and precipitate,10μl samplewas tested from the filtered clear supernatant.The sample preparationwas deproteinized and extracted w ith acetonitrile followed by HPLC-MS/MS inmultiple reactionmonitoringmode,the transition ions ofm/z342.2/116.1 and m/z342.2/ 324.2 were selected for quantification of propafenone,propafenonewas quantified based on external standard calibration curve.Results：The retention time of calibrationwas5.08min，calibration curvewere linear over the range of 1～1000 ng/m L(r=0.9984)and the lower lim itof quantitation(LOQ)was 0.1 ng/m L(S/N=10).The intra-and inter-day precisions(RSD)were 3.9%and 6.0%,respectively.The average extraction recovery was 96.5%.The analysiswas proved to be stable under room temperature.Conclusion：Themethodwas rapidly and easy to usew ith good sensitivity and specificity.Itcan beused for clinicaldiagnosisand treatment.

propafenone；liquid chromatography-tandem mass；blood analysis；poisoning

R 595.4

A

2095-3496（2013）03-0149-03

100071 北京，解放軍307醫(yī)院全軍中毒救治中心（孫成文，李嘉琳，徐水英，孫愛(ài)麗，趙玉婧，邱澤武）；北京市豐臺(tái)區(qū)疾病預(yù)防控制中心（王玉江）

邱澤武，E-mai l：qiuzw@em120.com