三刺皂莢黃化病植原體的分子鑒定

都業(yè)娟，李成亮，石寶萍，向本春

(石河子大學新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室，新疆石河子 832003)

植原體(Phytoplasma)原稱類菌原體(MLO)，屬柔膜菌綱，是重要的病原微生物。主要由取食植物韌皮部的葉蟬、飛虱等昆蟲傳播，可危害糧食、蔬菜、花卉、林木、雜草等各類植物，感病植株表現(xiàn)出黃化、頂枯、叢枝、簇生、花變?nèi)~、矮化、小葉等癥狀［1-2］。目前世界上已報道的植原體病害有1 000多種，我國迄今已報道的植原體病害有100余種［3］。由于植原體不能離體培養(yǎng)，所以不能用傳統(tǒng)的真菌和細菌的方法進行系統(tǒng)的分類鑒定。目前植原體分類主要依賴分子生物學方法，尤以植原體的一些保守序列，如16S rRNA基因序列、核糖體蛋白基因(rp)、延伸因子(tuf)基因、16-23S rRNA間區(qū)序列(16S-23S rRNA space region)、轉(zhuǎn)運蛋白(SecY)基因等，在檢測和鑒定中的應用越來越多［4］。

三刺皂莢Gleditsia triacanthos Lam.，豆科皂莢屬，又名三刺皂角、美國皂角，原產(chǎn)北美地區(qū)，后引進我國新疆、北京、山東、江蘇等地，是國外利用最廣，研究最深的一種皂莢。其具有耐干旱、耐鹽堿、生長速度適中、木材密度高、堅硬、耐用的優(yōu)點，是廣泛作為防風固沙林、經(jīng)濟林、用材林、綠化林的優(yōu)良樹種。本研究對采自新疆石河子地區(qū)表現(xiàn)黃化癥狀的三刺皂莢的病原，即植原體16S rRNA，16S-23S間區(qū)序列及tuf基因采用巢氏PCR進行分子生物學研究，明確三刺皂莢黃化病病原及株系的分類地位。

1 材料與方法

1.1 材料 2012年8月在新疆石河子采集健康的和表現(xiàn)黃化癥狀的三刺皂莢樣品。

1.2 總 DNA提取 參照 Qi等［5］的方法提取總DNA，分別提取感病及健康植株總 DNA，保存在-20℃冰箱中備用。

1.3 巢式PCR擴增 利用Nested-PCR對植原體的16S rRNA，16S-23S rRNA間區(qū)序列和tuf基因進行擴增。其中引物對 P1/P7［6］分別與 R16F2n/R16R2［7］，SR1/SR2［8］組合用于植原體 16S rRNA和16S-23S rRNA間區(qū)序列基因的擴增;tuf基因利用引物對 fTuf1/rTuf1和 fTufu/rTufu［9］組合擴增(表1)。

表1 用于植原體16S rRNA，16S-23S rRNA間區(qū)及tuf基因擴增的引物序列

1.4 核苷酸序列的測定與分析 PCR產(chǎn)物回收后連接載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，取白色菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。通過PCR篩選鑒定陽性克隆，送北京華大基因公司測序。

所得序列通過Blast在NCBI中搜索同源序列。利用DNAMAN和DNASTAR進行核苷酸分析;利用MEGA 5.0通過最小進化法(Minimum-Evolution，ME)構(gòu)建基于16S rRNA和tuf基因序列的系統(tǒng)進化樹;并利用植原體在線分析軟件iPhyClassifier對16S rRNA基因序列進行在線分析(http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA，16S-23S rRNA間區(qū)序列及tuf基因PCR擴增結(jié)果 以表現(xiàn)黃化癥狀三刺皂莢總DNA為模板，經(jīng) Nested-PCR擴增其 16S rRNA，16S-23S rRNA間區(qū)序列及tuf基因，分別得到約1.2，0.3，0.8 kb的植原體特異條帶，而健康三刺皂莢植株和雙純水對照未擴增出相應條帶。說明表現(xiàn)黃化落葉癥狀的三刺皂莢中存在植原體，此植原體暫命名為 Honeylocustyellowsphytoplasma(HoY)。

2.2 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建通過測定3個克隆確定HoY 16S rRNA基因擴增片段含1 248個核苷酸(GenBank No.KC242233)，G+C含量為45.8%。HoY與GeneBank中同源序列Blast結(jié)果顯示，該株系與榆樹黃化植原體組(Elm yellows group，16SrV)的棗瘋病植原體(Jujubewitches′-broom phytoplasma，GenBankNO:JQ675716)、山菊苣扁莖植原體(Puna chicory flat stem phytoplasma GenBank NO:JN582266)、杏卷葉植原體(Apricot leaf roll phytoplasma，GenBank NO:FJ572660)、金鐘花黃化植原體(Golden bellflower yellows phytoplasma，GenBank NO:HQ844237)、皂莢叢枝植原體(Honeylocust witches′-broom phytoplasma，GenBank NO:FJ457095)同源性均達99%以上，與河南許昌的棗瘋病植原體(JQ675716)同源率高達100%。將該序列用iPhyClassifier在線工具基于相似系數(shù)進行16S組及亞組的分類，結(jié)果顯示其虛擬RFLP圖譜與16SrV-B亞組參照株系(AB052876)的相似系數(shù)達1.00，因此認為HoY屬于16SrV-B亞組。

利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹顯示，HoY與16SrV-A，16SrV-B，16SrV-C，16SrV-D，16SrV-E 亞組聚集為同一進化分枝，并與16SrV-B亞組的AB052876，F(xiàn)J457095，JQ675716 聚為一簇(圖 1)。2.3 16S rRNA基因序列虛擬RFLP分析 對HoY的16S rRNA基因序列進行虛擬RFLP分析，結(jié)果顯示:HoY與16SrV-B亞組的參照株系棗瘋病植原體(AB052876)有相同的酶切圖譜;與16SrV-A亞組的榆黃化植原體(AY197655)在HpaⅡ，RsaI酶切位點存在差異;與16SrV-C亞組的金黃色植原體(AY197645)在BfaI，HpaⅡ和RsaI等3個酶切位點存在差異，與16SrV-D亞組的金黃色植原體(AY197644)在 BfaI，BstUI，HpaⅡ和 RsaI等 4 個酶切位點有差異;與16SrV-E亞組的懸鉤子矮化植原體(AY197648)在 BfaI，HpaⅡ，KpnI和 RsaI等 4 個酶切位點有差異(圖2)。

圖1 HoY及其它植原體基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進化樹

2.4 16S-23S rRNA間區(qū)序列分析 通過測定3個克隆確定HoY 16S-23S rRNA間區(qū)序列擴增片段含265個核苷酸(GenBank No.KC331053)，G+C含量為32.5%。將其與GeneBank中的同源序列進行比較分析顯示:HoY與16SrV組核苷酸序列同源性達97.8%～100%，并與我國報道的多個棗瘋病植原體(EF661582，GU184181，F(xiàn)J445389)核苷酸同源性達100%，與其他組植原體核苷酸同源性均低于92.0%。

2.5 tuf基因序列分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 通過測定3個克隆確定HoY tuf基因擴增片段由824個核苷酸組成(GenBank No.KC331043)，G+C含量為33.0%。與GeneBank中的同源序列比較，結(jié)果表明:HoY與16SrV組tuf基因核苷酸同源性均在91%以上，與我國報道的該組棗瘋病植原體GU723424， GU723423， GU968760， GU968759，GU137287同源性達99.5% ～100%，與該組其他亞組植原體的同源性為91.0% ～92.6%，而與其他組植原體同源性低于85.0%。利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹顯示:HoY與16SrV組植原體聚為同一進化分枝，并與棗瘋病植原體 GU723424，GU723423，GU968760，GU968759，GU137287 聚為一簇(圖3)。

圖2 HoY及相關(guān)亞組植原體16S rDNA的虛擬RFLP圖譜

圖3 HoY及其它植原體基于tuf基因序列的系統(tǒng)進化樹

3 討論

本研究利用Nested-PCR擴增三刺皂莢黃化病植原體(HoY)16S rRNA，16S-23S rRNA間區(qū)序列及tuf基因，通過對其進行序列分析、構(gòu)建基于16S rRNA和tuf基因的系統(tǒng)進化樹并利用iPhyClassifier對16S rRNA基因進行RFLP在線分析，明確HoY屬于榆樹黃化組B亞組(16SrV-B)。通過序列比較分析可知，相對于植原體16S rRNA基因組間的高度保守，植原體的16S-23S rRNA間區(qū)序列及tuf基因存在更多的變異，但組內(nèi)尤其是亞組內(nèi)序列的同源性很高，可作為植原體組及亞組的劃分補充依據(jù)。

我國2008年在陜西楊陵地區(qū)發(fā)現(xiàn)皂莢叢枝植原 體 (Honeylocustwitches′-broom phytoplasma，F(xiàn)J457095)可感染中國皂莢 Gleditsiasinensis Lam.［10］，引起叢枝、矮縮、小葉等癥狀。本文所報道的病害發(fā)生于三刺皂莢上，且癥狀表現(xiàn)為葉片黃化、后期植株莖干枯死，二者寄主及癥狀均不同;針對16S rRNA基因序列進行比對，二者在1030和1223位存在2個堿基的差異。

新疆得天獨厚的自然條件，非常適合葡萄、香梨、棗、杏等果樹生長，隨著新疆特色林果業(yè)的快速發(fā)展，新疆已成為我國重要水果產(chǎn)區(qū)之一，但近年相繼發(fā)現(xiàn)杏樹、棗樹感染植原體病害。新疆也是我國較早將三刺皂莢引入作為綠化樹種的地區(qū)，在南北疆均有分布。通過對 HoY的16S rRNA，16S-23S rRNA間區(qū)序列及tuf基因研究發(fā)現(xiàn)，其與我國多個棗瘋病植原體在不同位點存在高度同源性。2000年后新疆大力發(fā)展棗樹等特色林果種植，面積已突破73萬hm2，新疆不同樹種之間植原體病害存在何種關(guān)系，三刺皂莢黃化病植原體能否侵染其它果樹并對新疆林果業(yè)造成危害，有待進一步深入研究。

［1］ Bai X，Zhang J，Ewing A，et al.Living with genome instability:the adaptation of phytoplasmas to diverse environments of their insect and plant hosts［J］.Journal of Bacteriology，2006，188:3682-3696.

［2］ Hogenhout S A，Oshima K，Ammar D，et al.Phytoplasmas:bacteria that manipulate plants and insects［J］.Molecular Plant Pathology，2008，9(4):403-423.

［3］ 常文程，李向東，邵云華，等.棣棠叢枝病相關(guān)植原體的分子鑒定［J］.植物病理學報2012，42(5):541-545.

［4］ The IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Team.‘Candidatus Phytoplasma’，a taxon for the wall-less，non-helical prokaryotes that colonize plant phloem and insects［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2004，54:1243-1255.

［5］ 漆艷香，謝藝賢，張輝強，等.植原體DNA提取方法的改良［J］.生物技術(shù)通報，2004(4):44-46.

［6］ Deng S，Hiruki C.Amplification of 16S rDNA genes from culturable and nonculturable mollicutes［J］.Microbio Methds.1991，14:53-61.

［7］ Lee I M，Gundersen-Rindal D E，Davis R E，et al.Revised classification scheme of phytoplasmas based on RFLP analyses of 16S rRNA and ribosomal protein gene sequences［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1998，48:1153-1169.

［8］ Smart C D，Schneide B R，Blomouistl，et al.Phytoplasma specific PCR primers based on sequences of the 16S-23S rRNA spacer region［J］.Applied and Enviromental Microbiology，1996，18:2988-2993.

［9］ Schneider B，Gibb K S，Seemüller E.Sequence and RFLP analysis of the elongation factor Tu gene used in differentiation and classification of phytoplasmas［J］.Microbiology，1997，143:3381-3389.

［10］ Min H，Li Z N，Wu Y F，et al.Phytoplasma associated with a witches′broom disease of Gleditsia sinensis(Fabaceae)newly reported in China［J］.Plant Pathology，2009，58:790.

［11］ 李文慧，徐麟，何天明，等.杏褪綠卷葉病研究初報［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2007，16(6):207-209.

［12］ 韓劍，徐金虹，王同仁，等.棗瘋病植原體新疆分離物16S rDNA基因克隆與序列分析［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2012，21(4):176-180.