結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性研究進(jìn)展

王麗

（重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心，重慶 400036）

耐多藥結(jié)核（multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB）是指至少同時對異煙肼和利福平兩種一線抗結(jié)核藥物耐藥者。MDR-TB的治療周期較長，治療費用是普通結(jié)核患者的幾十倍甚至幾百倍，患者需要承擔(dān)巨大的經(jīng)濟壓力，更為危險的是其傳染性將使感染者也成為MDR-TB患者，這將給公眾健康造成巨大的威脅。

氟喹諾酮類藥物與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)合應(yīng)用治療結(jié)核病有20余年。臨床已有較多報道證明含氟喹諾酮類藥物的化療方案對初治肺結(jié)核的良好療效，對MDR-TB的治療也具有一定的治療效果。在世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南》（2008）中把抗結(jié)核藥物分為5組，第1組為一線口服抗結(jié)核藥物，第2組為注射用抗結(jié)核藥物，第3組為氟喹諾酮類藥物，第4組為口服抑菌二線抗結(jié)核藥物，第5組為MDR-TB治療中療效不確切的抗結(jié)核藥物?？菇Y(jié)核的氟喹諾酮類藥物包括左氧氟沙星、莫西沙星、氧氟沙星，其抗結(jié)核作用從大至小依次為莫西沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星。

氟喹諾酮類藥物的主要優(yōu)點是胃腸道易吸收，消除半衰期較長，組織穿透性好，分布容積大，毒副作用相對較小，適合于長程給藥。在治療肺結(jié)核中具有良好的藥物動力學(xué)特性，且大多表現(xiàn)出很好的口服生物利用度，其最大血漿濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過結(jié)核分枝桿菌的最低抑菌濃度（MIC）。大多數(shù)氟喹諾酮類藥物的抗結(jié)核活性與異煙肼、對氨基水楊酸、鏈霉素相當(dāng)，即使對異煙肼、對氨基水楊酸、鏈霉素耐藥的結(jié)核桿菌對氟喹諾酮類仍很敏感，且二者無交叉耐藥性。由此可見氟喹諾酮類在治療MDR-TB中具有舉足輕重的作用。

但是，隨著氟喹諾酮類藥物在治療MDR-TB中的應(yīng)用日益廣泛，結(jié)核分枝桿菌對其耐藥性逐漸增加，特別是當(dāng)不合理用藥時更易發(fā)生。廣泛耐藥結(jié)核（extensively-drug resistant tuberculosis，XDR-TB）于2006年3月首次發(fā)現(xiàn)。XDR-TB在耐異煙肼和利福平基礎(chǔ)上，對兩種最主要的二線抗結(jié)核藥物注射劑以及氟喹諾酮類藥物也耐藥。因此，研究其耐藥機制、加強合理應(yīng)用以控制耐藥性的增長是非常有必要的。

1 氟喹諾酮類藥物耐藥現(xiàn)狀

由于二線抗結(jié)核藥物的MIC與判定耐藥的臨界值較為接近，對于氟喹諾酮類等二線抗結(jié)核藥物的藥敏檢測難度較大，國際上尚未制定統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)，因此目前全球范圍內(nèi)尚無氟喹諾酮類治療MDR-TB的耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)，但是研究者們也在努力，一些小樣本量的研究數(shù)據(jù)時有報道。

印度的1項MDR-TB耐藥監(jiān)測顯示，僅對異煙肼和利福平耐藥的MDR-TB對環(huán)丙沙星和氧氟沙星均敏感，對異煙肼、利福平、鏈霉素及乙胺丁醇4種藥物全部耐藥者對環(huán)丙沙星和氧氟沙星的耐藥率分別為16%和10%[1]。菲律賓的耐藥情況最嚴(yán)重，在MDR-TB中，耐2種藥物者對氟喹諾酮類的耐藥率為18.2%，耐3種藥物者為23.3%，耐4種或5種藥物者為53.4%。因此，為減輕抗菌藥物選擇性壓力，在菲律賓的臨床指南中不推薦氟喹諾酮類用于社區(qū)獲得性肺炎的治療[2]。

Huang TS等[3]研究了結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類的耐藥性。他們把收集的菌株分為3組：對一線抗結(jié)核藥物敏感的菌株、MDR-TB菌株及其他聯(lián)合用藥耐藥的菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDR-TB菌株中出現(xiàn)的耐氟喹諾酮類菌株增加的趨勢明顯，1995-1997年組的菌株耐藥率為 7.7%，1998-2000年組的耐藥率則上升到22.2%，環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星之間還出現(xiàn)了交叉耐藥性。

崔振玲等[4]對結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星3種臨床常用的氟喹諾酮類藥物的敏感性進(jìn)行分析研究。該研究采用液體培養(yǎng)基聯(lián)合四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）行抗結(jié)核藥物的MIC檢測。對不同結(jié)核病患者的163株臨床分離株進(jìn)行氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星3種藥物的MIC檢測和Bactec MGIT 960藥敏檢測。結(jié)果163株菌株中氧氟沙星耐藥株占35.6%；MDR-TB菌株中，氧氟沙星耐藥率為73.5%，MDR-TB菌株中左氧氟沙星耐藥率超過一半以上；所有結(jié)核菌株莫西沙星的MIC值均≤1μg/mL。由此可見目前在結(jié)核桿菌臨床分離株中，氧氟沙星和左氧氟沙星已出現(xiàn)較高的耐藥率，值得引起臨床醫(yī)生的重視，莫西沙星在MDR-TB中顯示出良好的抗菌效果，給MDR-TB的治療帶來希望。

2 耐藥檢測方法

結(jié)核桿菌生長周期長，傳統(tǒng)的藥敏檢測方法以培養(yǎng)為基礎(chǔ)，通常需要1個月左右才能得到結(jié)果，比較費時。因此耐藥基因的檢測受到研究者的青睞。Bravo LT等[5]采用焦磷酸測序技術(shù)檢測氟喹諾酮類的耐藥基因型，氟喹諾酮類耐藥株gyrA基因突變率為85%。

Devasia RA等[6]用比例法、分枝桿菌生長指示管檢測法、顯微鏡觀察法和硝酸還原酶測定法探討了氟喹諾酮類的交叉耐藥性。氧氟沙星耐藥菌株同時采用4種方法測定環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星的敏感情況。結(jié)果顯示797株分離菌株中，19株（2.4%）對氧氟沙星耐藥，所有19株氧氟沙星耐藥株均對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星耐藥。分枝桿菌生長指示管檢測法、顯微鏡觀察法和硝酸還原酶測定法3種藥敏測試方法均有敏感特異性，且較比例法更快速。

3 氟喹諾酮類藥物耐藥原因分析

3.1 基因突變

氟喹諾酮類藥物主要作用于結(jié)核分枝桿菌的脫氧核糖核酸（DNA）回旋酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ）。DNA回旋酶是由2個A亞基和2個B亞基構(gòu)成的四聚體，分別由gyrA和gyrB基因編碼，形成具有催化活性的GyrA2GyrB2絡(luò)合物，gyrA基因突變主要集中在一個較小的區(qū)域，將這一基因區(qū)域稱為喹諾酮耐藥決定區(qū)（quinolones resistance determining region，QRDR）。結(jié)核分枝桿菌耐藥機制主要為基因突變，實驗室研究證明gyrA基因上單一的錯義突變與低水平氟喹諾酮類耐藥有關(guān)，而高水平耐藥一般在gyrA基因上發(fā)生兩個錯義突變，或者一個為gyrA突變，另一個為gyrB突變。

結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類產(chǎn)生自發(fā)突變率很低，且各品種間大致相同，為1/106～ 1/107。耐藥幾乎全發(fā)生在染色體上，只有個別報道發(fā)生在質(zhì)粒上。所有耐藥株的MIC增加2～32倍。國內(nèi)外很多研究者從分子水平對氟喹諾酮類在治療結(jié)核病中產(chǎn)生耐藥的機制作了研究[7]。Cheng AF等[8]研究發(fā)現(xiàn)6種主要的氟喹諾酮類之間出現(xiàn)交叉耐藥性主要是由結(jié)核桿菌回旋酶A亞單位基因突變導(dǎo)致的。趙蘭等[9]的研究發(fā)現(xiàn)81.5%的氟喹諾酮類耐藥菌株gyrA基因在QRDR區(qū)域發(fā)生突變，而且其特異性很高，因此可以通過檢測gyrA基因的突變預(yù)測菌株對氟喹諾酮類藥物的耐藥表型。

趙偉杰等[10]探討了莫西沙星與左氧氟沙星對結(jié)核分枝桿菌的交叉耐藥性及耐藥基因突變位點，研究表明莫西沙星和左氧氟沙星為不完全交叉耐藥；gyrA基因90位、94位密碼子是耐藥基因突變位點，低耐藥與高耐藥的突變氨基酸種類有差別。

Von Groll A等[11]研究了結(jié)核菌株對氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星的耐藥性，并檢測了gyrA或gyrB基因突變情況。結(jié)果40株菌株對氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星耐藥，只有1株菌株在gyrB的Asn533Thr突變，可見高耐藥與多重突變有關(guān)。

盧旺達(dá)地區(qū)的研究人員發(fā)現(xiàn)氧氟沙星耐藥菌株有 gyrA、Thr80Ala、Asp94Ala突變，其 MIC 增加2～ 8倍[12]。Aubry A等[13]研究發(fā)現(xiàn)氧氟沙星耐藥與GyrB N510D突變有關(guān)，一些GyrA T80A和A90G同時突變的菌株卻對氧氟沙星和其他氟喹諾酮類高度敏感。Matrat S[14]等發(fā)現(xiàn)GyrA G88C突變和新的GyrA G88A突變導(dǎo)致了氟喹諾酮類耐藥，但是耐藥程度取決于R6和R7殘基取代后的氟喹諾酮類結(jié)構(gòu)。

全球許多地區(qū)都出現(xiàn)了耐氟喹諾酮類的結(jié)核臨床分離菌株。Yin X等[15]研究了中國廣州臨床分離的耐氟喹諾酮類菌株gyrA和gyrB基因的分子特征。每株菌株的表型敏感性通過絕對濃度法和QRDR的gyrA和gyrB基因DNA直接測序法測定。73.3%的左氧氟沙星耐藥株在gyrA上有突變，單一密碼子突變有 6個位點（H70R，A90V，S91A，D94G，D94A或D94N），還有雙位點突變 A90V和D94A，在60株 LVX耐藥株中，只有1株是 gyrB T511N突變。研究結(jié)果證實了gyrA基因90、91、94位點突變是主要的氟喹諾酮類耐藥機制。

3.2 其他耐藥機制

目前的研究表明gyrA突變是氟喹諾酮類耐藥的最主要因素，其他可能導(dǎo)致耐藥的因素有QRDR之外的gryA或gyrB突變；細(xì)胞壁對藥物的滲透性降低；藥物被泵排出，使得胞內(nèi)藥物濃度不能有效抑制或殺滅分枝桿菌；藥物的隔離或藥物失活。Von Groll A等[11]研究發(fā)現(xiàn)1株菌株在gyrA和gyrB基因上無突變，但是對氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星耐藥，推測可能是基因突變區(qū)在檢測區(qū)之外或者是分子改變，減少了細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。

3.3 抗結(jié)核治療中氟喹諾酮類藥物的使用

Xu P等[16]調(diào)查研究了中國上海結(jié)核病人中氟喹諾酮類的耐藥情況。605例肺結(jié)核病人中，表型氟喹諾酮類耐藥分離株gyrA突變率為81.5%，對一線藥物全敏感的菌株gyrA突變率為1.9%，耐多藥菌株為25.1%，氟喹諾酮類耐藥與至少1種一線抗結(jié)核藥物耐藥有關(guān)，也與用氟喹諾酮類治療結(jié)核有關(guān)。在抗結(jié)核治療中使用氟喹諾酮類更容易導(dǎo)致復(fù)治病人對氟喹諾酮類的獲得性耐藥。

臺灣的研究者[3]對1995-2003年臺灣醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)內(nèi)結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類的耐藥趨勢作了回顧性分析，發(fā)現(xiàn)只有MDR-TB分離株使氟喹諾酮類的MIC增加，結(jié)果顯示在MDR-TB治療中使用氟喹諾酮類與其耐藥具有相關(guān)性，而與氟喹諾酮類在其他感染性疾病治療中的使用無關(guān)。Wang JY等[17]研究發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類耐藥與一線抗結(jié)核藥物耐藥有關(guān)，也與既往結(jié)核治療史有關(guān)，而與氟喹諾酮類的使用無關(guān)。28株氟喹諾酮類敏感株和8株氟喹諾酮類耐藥株gyrA、gyrB上無突變。臨床分離株氟喹諾酮類的耐藥率為3.3%，分離的MDR-TB菌株對氟喹諾酮類的耐藥率為19%。對一線藥物耐藥的菌株更容易對氟喹諾酮類耐藥，這種關(guān)系在MDR-TB中更加明顯。氟喹諾酮類藥物在耐藥病人或不能耐受一線抗結(jié)核藥物時仍然使用。但是Webster D等[18]研究發(fā)現(xiàn)有氟喹諾酮類既往用藥史的患者比未使用過氟喹諾酮類的患者更容易耐藥。

研究者調(diào)查了美國大量人群中氟喹諾酮類藥物的耐藥趨勢及危險系數(shù)[19]。采用瓊脂比例法確定氟喹諾酮類藥物是否耐藥，氧氟沙星耐藥界限為2 μg/mL。640 例患者中，116 例（18%）在診斷前 12個月有氟喹諾酮類用藥史。16例（2.5%）對氟喹諾酮類耐藥。在54例氟喹諾酮類用藥超過10天的患者中，7例（13%）對氟喹諾酮類耐藥。雖然氟喹諾酮類耐藥率相對較低，但是診斷前超過10天的氟喹諾酮類用藥史與其耐藥有關(guān)，診斷前超過60天的氟喹諾酮類用藥史，則耐藥風(fēng)險最大。Long R等[20]發(fā)現(xiàn)單個的氟喹諾酮類處方與氟喹諾酮類耐藥無關(guān)，多聯(lián)的氟喹諾酮類處方與氟喹諾酮類耐藥有關(guān)。

4 結(jié)論

目前的文獻(xiàn)報道中，各個國家和地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率存在較大的差異，這個差異可能與檢測方法、菌株的來源、樣本量的大小有關(guān)。在氟喹諾酮類耐藥率較高的地區(qū)，對臨床分離的結(jié)核菌株應(yīng)進(jìn)行常規(guī)的藥敏檢測，尤其是對耐藥菌株、有結(jié)核病史或使用過抗結(jié)核藥物者。目前報道的基因突變率存在差異，氟喹諾酮類的耐藥機制還沒有完全清楚，gyrA基因突變不能完全預(yù)測是否對氟喹諾酮類藥物表型耐藥。耐藥分為基因型耐藥、表型耐藥、臨床耐藥，基因型耐藥不一定有表型耐藥，表型耐藥不一定有臨床耐藥?；蛲蛔兒湍退幈硇筒⒎且灰粚?yīng)，只能作為快速檢測的輔助手段。傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗為表型耐藥檢測方法，建立在結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)基礎(chǔ)之上，需要4～6周時間，不能滿足臨床治療的需要。基因突變的檢測可以預(yù)測菌株對氟喹諾酮類的耐藥表型。而篩選gyrA基因突變來檢測氟喹諾酮類的耐藥性，依賴于研究位點和采樣、氟喹諾酮類的耐藥流行情況和研究設(shè)計方案。

因此目前還不能把基因檢測作為一種常規(guī)手段來預(yù)測結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類的耐藥性。WHO推薦的經(jīng)典的氟喹諾酮類藥敏試驗方法為比例法，這種以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)藥敏檢測方法雖然費時費力，但是其結(jié)果可信度較高，可以為臨床醫(yī)生選擇藥物時提供有力的參考，目前也有液體培養(yǎng)的快速培養(yǎng)方法可以縮短時間。但是目前常規(guī)藥敏試驗中只有左氧氟沙星，建議同時開展其他幾種氟喹諾酮類的藥敏試驗，為MDR-TB患者提供準(zhǔn)確的用藥依據(jù)。臨床醫(yī)生更加需要重視合理用藥，避免耐藥的進(jìn)一步發(fā)生。

[1]Dam T，Isa M，Bose M.Drug-sensitivity profile of clinical Mycobacterium tuberculosis isolates-a retrospective study from a chest-disease institute in India[J].J Med Microbiol，2005，54（Pt 3）：269-271.

[2]Ginsburg AS，Grosset JH，Bishai WR.Fluoroquinolones，tuberculosis，and resistance[J].Lancet Infect Dis，2003，3（7）：432-442.

[3]Huang TS，Kunin CM，Shin-Jung Lee S，et al.Trends in fluoroquinolone resistance of Mycobacterium tuberculosis complex in a Taiwanese medical centre：1995-2003[J].J Antimicrob Chemother，2005，56（6）：1058-1062.

[4]崔振玲，王潔，陸俊梅，等.結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對三種氟喹諾酮類藥物的敏感性分析研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2009，3（12）：1-4.

[5]Bravo LT，Tuohy MJ，Ang C，et al.Pyrosequencing for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis resistance to rifampin，isoniazid，andfluoroquinolones[J].JClinMicrobiol，2009，47（12）：3985-3990.

[6]Devasia RA，Blackman A，May C，et al.Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis：an assessment of MGIT 960，MODS and nitrate reductase assay and fluoroquinolone cross-resistance[J].J Antimicrob Chemother，2009， 63（6）：1173-1178.

[7]Sulochana S，Narayanan S，Paramasivan CN，et al.Analysis of fluoroquinolone resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from India[J].J Chemother，2007，19（2）：166-171.

[8]Cheng AF，Yew WW，Chan EW.et al.Multiplex PCR amplimer conformation analysis for rapid detection of gyrA mutations in fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates[J].Antimicrob Agents Chemother，2004，48（2）：596-601.

[9]趙蘭，樂軍，王明貴.結(jié)核分枝桿菌對喹諾酮類藥物耐藥及機制研究進(jìn)展[J].中華臨床感染病雜志，2008，1（5）：307-310.

[10]趙偉杰，李莧，陸宇.莫西沙星與左氟沙星對結(jié)核分枝桿菌的交叉耐藥性研究[J].結(jié)核病與胸部腫瘤，2008，（4）：246-249.

[11]Von Groll A，Martin A，Jureen P，et al.Fluoroquinolone Resistance in Mycobacterium tuberculosis and Mutations in gyrA and gyrB[J].AntimicrobAgentsChemother，2009，53（10）：4498-4500.

[12]Umubyeyi AN，Rigouts L，Shamputa IC，et al.Limited fluoroquinolone resistance among Mycobacterium tuberculosis isolates from Rwanda：results of a national survey[J].J Antimicrob Chemother，2007，59（5）：1031-1033.

[13]Aubry A，Veziris N，Cambau E，et al.Novel gyrase mutations in quinolone-resistant and-hypersusceptible clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis：functional analysis of mutant enzymes[J].Antimicrob Agents Chemother，2006，50（1）： 104-112.

[14]Matrat S，Veziris N，Mayer C ，et al.Functional analysis of DNA gyrase mutant enzymes carrying mutations at position 88 in the A subunit found in clinical strains of Mycobacterium tuberculosis resistant to fluoroquinolones[J].Antimicrob Agents Chemother，2006，50（12）：4170-4173.

[15]Yin X，Yu Z.Mutation characterization of gyrA and gyrB genes in levofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from guangdong province in China[J].J Infect，2010，61（2）：150-154.

[16]Xu P，Li X，Zhao M ，et al.Prevalence of fluoroquinolone resistance among tuberculosis patients in Shanghai，China[J].Antimicrob Agents Chemother，2009，53（7）：3170-3172.

[17]Wang JY，Lee LN，Lai HC，et al.Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates：associated genetic mutations and relationship to antimicrobial exposure[J].J Antimicrob Chemother，2007，59（5）：860-865.

[18]Webster D，Long R，Shandro C，et al.Fluoroquinolone resistance in renal isolates of Mycobacterium tuberculosis[J].Int J Tuberc Lung Dis，2010，14（2）：217-222.

[19]Devasia RA，Blackman A，Gebretsadik T，et al.Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis：the effect of duration and timing of fluoroquinolone exposure[J].Am J Respir Crit Care Med，2009，180（4）：365-370.

[20]Long R，Chong H，Hoeppner V，et al.Empirical treatment of community-acquired pneumonia and the development of fluoroquinolone-resistant tuberculosis[J].Clin Infect Dis，2009，48（10）：1354-1360.