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    馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測(cè)技術(shù)比較與選擇

    2013-01-22 12:02:19邱彩玲呂文河呂典秋李學(xué)湛白艷菊
    中國(guó)馬鈴薯 2013年6期
    關(guān)鍵詞:生物素種薯種苗

    邱彩玲,呂文河,魏 琪,呂典秋,李學(xué)湛,白艷菊*

    (1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所,黑龍江 哈爾濱 150086;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150030)

    馬鈴薯,其經(jīng)濟(jì)價(jià)值在全世界的作物中占第四位。然而,諸多的病害卻威脅著馬鈴薯的生產(chǎn),其中馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)就是其中重要的一種。PSTVd自1922年發(fā)現(xiàn)以來,已經(jīng)迅速地傳播到了許多國(guó)家,如加拿大、阿根廷、俄羅斯(前蘇聯(lián))、波蘭、匈牙利和保加利亞等,后來又傳入中國(guó),并已經(jīng)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。

    PSTVd具有高度的侵染性,是引起馬鈴薯品種退化和產(chǎn)量降低的主要病害之一。PSTVd強(qiáng)系可引起減產(chǎn)60%,弱系減產(chǎn)20%~35%,并且會(huì)使塊莖畸形,變小,降低馬鈴薯的產(chǎn)量和商品性,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病害危害重,易傳播,因此,中國(guó)及很多國(guó)家和地區(qū)都將其列為檢疫性病害,足見此病害的嚴(yán)重性。PSTVd在中國(guó)分布廣泛,一些染病地區(qū)馬鈴薯減產(chǎn)幅度高達(dá)80%。

    由于PSTVd能夠隨著馬鈴薯的無性繁殖傳遞給后代,而且目前還很難通過莖尖剝離或者超低溫處理等方法將其徹底脫除,因此,目前控制該病害的最主要方法是通過嚴(yán)格的檢驗(yàn)檢疫,生產(chǎn)無毒種薯,從源頭上控制該病害的發(fā)生和傳播。因此,用于檢驗(yàn)PSTVd的技術(shù)就成為了控制該病害的關(guān)鍵所在。

    目前,全世界普遍采用的檢測(cè)PSTVd的方法有生物學(xué)方法(接種鑒定)、電子顯微鏡技術(shù)、往返-聚丙烯酰 胺 凝 膠 電 泳(Return-polyacrylamide gel electrophoresis,R-PAGE)、核酸斑點(diǎn)雜交(Nucleic acid spot hybridization,NASH)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR(Real-time Fluorescent Quantitative Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction,FQ RT-PCR)等,這些檢測(cè)方法都各有利弊,我們應(yīng)首先了解這些方法的特點(diǎn),然后根據(jù)自身?xiàng)l件等合理地選擇檢測(cè)方法,更好地控制馬鈴薯脫毒種薯和種苗的質(zhì)量。

    1 檢測(cè)技術(shù)

    1.1 生物學(xué)方法

    傳統(tǒng)的生物學(xué)鑒定方法是以植物病原在寄主上的表現(xiàn)癥狀作為識(shí)別病害和鑒定病原的基礎(chǔ)。該方法一般分為目測(cè)法和指示植物法兩種,前者主要利用病原在寄主上的癥狀來區(qū)別寄主是否受到感染,指示植物法則是利用一些模式植物上出現(xiàn)的特征來鑒別是否存在病原感染的方法。1964年,Raymer等[1]利用番茄作為PSTVd的指示植物進(jìn)行PSTVd鑒定,該方法是利用生物學(xué)方法檢測(cè)PSTVd最基本、最早的方法。大體做法是在番茄長(zhǎng)到兩片真葉時(shí),在27~30℃,10 000 Lx光照下進(jìn)行接種,接種后2~4周或更長(zhǎng)時(shí)間,觀察植株表現(xiàn),感染PSTVd的植株一般會(huì)出現(xiàn)矮化,頂部新生葉片變小,扭曲,粗縮,下卷,葉片淡綠色,逐漸發(fā)生中脈和支脈壞死等癥狀。利用該方法還可鑒定PSTVd株系致病性的強(qiáng)弱,目前仍然是研究PSTVd及其相關(guān)領(lǐng)域不可或缺的基本方法。但該方法具有諸多缺點(diǎn),如鑒定周期長(zhǎng),受溫度、光照等環(huán)境條件影響大等,對(duì)于不同品種和環(huán)境有不同的表現(xiàn),并且還存在潛伏侵染等情況,因此,此方法一般不適于日常檢測(cè)。

    1.2 電子顯微鏡技術(shù)

    20世紀(jì)70年代,Sogo等[2]就利用電子顯微鏡對(duì)PSTVd進(jìn)行了檢測(cè)和觀察,從而確定了PSTVd的形態(tài)和大小等信息,為PSTVd的相關(guān)研究工作打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。該方法具有快速、簡(jiǎn)單、直接等優(yōu)點(diǎn),但是,該方法需要一定的專業(yè)電鏡操作技能,且電子顯微鏡體積龐大,要求高,需要專門的實(shí)驗(yàn)室安放,價(jià)格昂貴,一般的實(shí)驗(yàn)室不具備該設(shè)備,因此,不適于大面積推廣用于日常PSTVd檢測(cè)。

    1.3 往返電泳法

    一些研究者利用R-PAGE成功檢測(cè)PSTVd[3,4],該方法后來被廣泛應(yīng)用于PSTVd的檢測(cè)。該方法克服了生物學(xué)方法需要周期長(zhǎng),受環(huán)境影響大的缺點(diǎn),同時(shí)不需要像電子顯微鏡那樣的設(shè)備,在一段時(shí)間內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。之后又對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn),使之可根據(jù)PSTVd電泳遷移率來鑒定PSTVd的致病性。目前,該方法仍在一定范圍內(nèi)應(yīng)用。然而,雖然該方法克服了以往檢測(cè)技術(shù)的諸多缺點(diǎn),但該技術(shù)仍然存在一定的不足,如檢測(cè)靈敏度低,一次性檢測(cè)樣品量小等,不適于大量樣品的檢測(cè)。

    1.4 核酸斑點(diǎn)雜交

    隨著生物技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展,越來越多的生物技術(shù)可以被應(yīng)用于PSTVd的檢測(cè),國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者都開始應(yīng)用NASH檢測(cè)PSTVd[5-7]。此法基于互補(bǔ)堿基的結(jié)合,因而可靠、靈敏度高。1989年以后,32P和生物素先后被應(yīng)用于cDNA探針的標(biāo)記[8,9],但是,32P半衰期短,有放射性危害,對(duì)操作及廢物處理要求嚴(yán)格,而生物素成本較高,因此,這兩種方法都沒有廣泛普及。1992年,何小源和周廣和[10]用光敏生物素標(biāo)記了PCR擴(kuò)增后的PSTVd-cDNA探針。1997年,董江麗等[11]用長(zhǎng)臂光敏生物素標(biāo)記cDNA探針,克服了之前的一些弊端,使該技術(shù)更具實(shí)用性。2009年,邱彩玲等[12]利用地高辛標(biāo)記的探針及其核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)PSTVd試劑盒的成功研制為核酸斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)PSTVd開拓了更為簡(jiǎn)便的途徑。經(jīng)過諸多學(xué)者的共同努力,現(xiàn)在利用NASH方法檢測(cè)PSTVd已經(jīng)變得非常簡(jiǎn)便,一次可以檢測(cè)大量樣品,靈敏度高,操作簡(jiǎn)單,對(duì)環(huán)境友好,對(duì)操作人員沒有危害,是日常檢測(cè)PSTVd非常便利且有效的方法。

    1.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

    RT-PCR是指在對(duì)類病毒RNA基因組進(jìn)行擴(kuò)增之前需要先用逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse transcriptase)在引物的引導(dǎo)下先合成與類病毒基因組互補(bǔ)的DNA(Complementary DNA,cDNA),然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。該方法具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),但是,非特異性擴(kuò)增是RT-PCR方法原理上的缺陷,容易受到試劑、引物等的污染而出現(xiàn)假陽性,因此檢測(cè)結(jié)果往往不可靠,但是對(duì)于類病毒的基因組序列分析卻非常重要。

    1.6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

    FQ RT-PCR是檢測(cè)低豐度RNA的敏感方法,該方法是在RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種靈敏度較高的核酸定量技術(shù),該技術(shù)已經(jīng)被成功的用于檢測(cè)植物病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒類病毒。這種方法檢測(cè)靈敏度高,且可以定量。然而,Real-time PCR儀及相關(guān)的試劑和耗材價(jià)格昂貴,檢測(cè)成本非常高,而且對(duì)于種薯和種苗質(zhì)量檢測(cè)來講,并不需要知道其感染PSTVd的濃度,只需要知道感染與否即可,因此,此方法一般不用于日常檢測(cè),僅適于有特殊要求或者非常重要的資源的檢測(cè)。

    除上述幾種常見的檢測(cè)方法以外,還有基因芯片、寡核苷酸微點(diǎn)陣技術(shù)等,只是這些方法目前普及率比較低。

    2 如何選擇合適的檢測(cè)技術(shù)

    對(duì)于種薯和種苗生產(chǎn)者來說,為了生產(chǎn)合格的脫毒種薯和種苗,PSTVd是必須要檢測(cè)的一個(gè)重要參數(shù)。那么,面對(duì)眾多的檢測(cè)技術(shù)和方法,我們應(yīng)該如何選擇符合自己需要的檢測(cè)技術(shù)呢?以下幾方面是要重點(diǎn)考慮的因素。

    2.1 檢測(cè)目的及要求

    檢測(cè)目的和要求是我們首先要考慮的問題,對(duì)于即將用于擴(kuò)繁的種苗來講,此階段需要檢測(cè)的樣品數(shù)量少且尤為重要,因此,在條件允許的情況下,應(yīng)盡可能選擇靈敏度較高的技術(shù),以確保擴(kuò)繁種苗的質(zhì)量,避免后期造成無法挽回的損失。如果是已經(jīng)擴(kuò)繁到很多種苗或者進(jìn)行田間大范圍檢測(cè),適宜采用靈敏度較高且一次可以檢測(cè)大量樣品的方法,如NASH,這樣既可保證靈敏度,又可節(jié)約人力物力,提高工作效率,節(jié)約成本。

    2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)施及經(jīng)費(fèi)條件

    在選擇檢測(cè)技術(shù)的時(shí)候,實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)施是必須考慮的因素之一,不同的檢測(cè)方法需要不同的設(shè)備,要全方位考慮問題,作出適當(dāng)?shù)倪x擇,在保證檢測(cè)質(zhì)量的同時(shí)盡可能減少不必要的經(jīng)費(fèi)支出。

    當(dāng)然,上述參考意見僅考慮技術(shù)層面等相關(guān)的問題,并沒有涉及法律、法規(guī)等因素,因此,種薯和種苗生產(chǎn)者還應(yīng)深入學(xué)習(xí)相關(guān)的法律法規(guī),熟悉各種相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)程,在確保種薯、種苗質(zhì)量的同時(shí),合理地保護(hù)自己和他人的合法利益。

    [1]Raymer W B,O’Brien M J,Merriam D.Tomato as a source of an indicator plant for the potato spindle tuber virus[J].Amer Potato J,1964,41:311-314.

    [2] Sogo J M,Koller T,Diener T O.Potato spindle tuber viroid:X. Visualization and size determination by electron microscopy[J]. Virology,1973,55(1):70-80.

    [3] Schumann G L,Thurston H D,Horst R K.Comparison of tomato bioassay and slab gel electrophoresis for detection of potato spindle tuber viroid in potato[J].Phytopathology,1978,68:1256-1259.

    [4] Pfannenstiel M A,Slaok S A,Lane L C.Detection of potato spindle tuber viroid in field-grown potatoes by an improved electrophoretic assay[J].Phytopathology,1980(70):1015-1018.

    [5] Barker J M,Mclnnes J L,Murphy P J,et al.Dot-blot procedure with(32P)DNA probes for the sensitive detection of avocado sunblotch and other viroids in plants[J].Virol Meth,1985,10: 87-98.

    [6] Maule A J.The application of spot hybridization to the detection of DNA and RNA viruses in plant tissues[J].Virol Meth,1983,6: 215-224.

    [7]呂典秋,李學(xué)湛,白艷菊,等.NASH技術(shù)和R-PAGE技術(shù)在馬鈴薯類病毒檢測(cè)上的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,34(1): 15-18.

    [8]曹先維,張鶴玲.用32P-cDNA探針核酸斑點(diǎn)雜交鑒定PSTV[C].中國(guó)馬鈴薯和甘薯合作研究進(jìn)展,1986~1989.1989:71-78.

    [9]張鶴齡,曹先維,Ilse Balbo,等.用生物素標(biāo)記cDNA探針檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒[J].病毒學(xué)報(bào),1989,5(1):72-75.

    [10]何小源,周廣和.應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增和光敏生物素標(biāo)記的cDNA探針檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒[J].病毒學(xué)報(bào),1992,8(4):337-341.

    [11]董江麗,哈斯阿古拉,張彤,等.用長(zhǎng)臂光敏生物素標(biāo)記的cDNA探針核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1997,28(4):537-540.

    [12]邱彩玲,劉尚武,王紹鵬,等.馬鈴薯類病毒的危害及NASH檢測(cè)試劑盒的研制[M]//.陳伊里,屈冬玉.馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與糧食安全.哈爾濱:哈爾濱工程大學(xué)出版社,2009.

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